방향적 진화를 이용한 단백질 개량(Directed Evolution of Gene)

최초 등록일
2017.09.09
최종 저작일
2015.09
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소개글

방향적 진화를 이용한 단백질 개량(directed evolution)의 실험과정과 목표 그리고 결과에 대한 실험보고서 입니다. DNA mutation은 ep-PCR과 StEPPCR기법을 이용하여 실시하였으며 간단한 실험방법인 PCR기법, 형질전환부터 실험에 쓰인 시약, Mutagenesis 실험과정과 원리를 분자적 수준에서 본문에 정리하였습니다.

목차

1. 실험목적

2. 실험원리
(1) Directed evolution
(2) Error prone PCR(epPCR)
(3) StEP PCR(Staggered Extension Process PCR)
(4) DNA Shuffling

3. 실험방법
(1) Error prone PCR(epPCR) protocol
(2) Gel elution
(3) StEP PCR protocol
(4) DNA Shuffling protocol

4. 결과
(1) Error prone PCR 결과 및 고찰
(2) StEP PCR protocol 결과 및 고찰
(3) DNA Shuffling 결과 및 고찰

본문내용

1. 실험목적
beta-glucosidase는 리포터 유전자로서 X-gal을 함유하는 배지에 이 유전자가 형질전환된 대장균을 키우면 colony가 파랑색을 띤다. 54KDa의 wild type은 protein의size가 커서 host cell에 stress를 주기 때문에 약 36amino acids를 serial deletion하여 활성부위만 갖는 유전자를 얻었지만 효소활성이 크게 줄었다. 따라서 본 실험에서는 이 축소된 리포터 유전자의 활성을 살리기 위하여 directed evolution을 통해 activity가 높아진 mutant를 찾고자 한다.

2. 실험원리
(1) Directed evolution
Directed evolution은 origin이 인위적으로 바뀌어도 안정화된 결과를 얻을 수 있고, 높은 효율성, 효소의 구조나 촉매 매커니즘을 알지 못해도 개량할 수 있다는 장점이 있어 현제 산업에서 널리 쓰이고 있는 전략이다. 그러나 변화된 기능에 대한 매커니즘 해석이 어렵고 안전성에 대한 검사를 추가로 해주어야 한다.
directed evolution에서 mutant library는 Error prone PCR을 이용하였고 StEP PCR과shuffling으로 mutation들이 섞이도록 하여 궁극적으로 유용한 mutation product를 screening하는 과정을 거쳤다.

(2) Error prone PCR(epPCR)
PCR material의 조성을 바꾸면 Taq polymerase의 fidelity를 낮아지는 성질을 이용한 방법이다. 주로 MgCl2의 농도 증가, MnCl2 첨가, .불균형의 뉴클레오티드 농도, Taq polymerase 농도 증가, nucleoside 유사물질 첨가등 PCR 수행조건을 다르게 해준다. 우리는 solvent인 1-propanol을 PCR반응에 첨가하였다. 단백질의 3차 구조를 형성하는데는 여러 약한 힘과 함께 소수성결합이 매우 중요하다.

참고 자료

없음

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