최신검증자료 스토어

최신검증자료

개인인증

팔로워6 팔로우

소개

등록된 소개글이 없습니다.

전문분야 등록된 전문분야가 없습니다.

판매자 정보

학교정보

입력된 정보가 없습니다.

직장정보

입력된 정보가 없습니다.

자격증

입력된 정보가 없습니다.

판매지수

판매중 자료수

30개
전체 판매량

1,000+개
최근 3개월 판매량

2개
자료후기 점수

평균A
자료문의 응답률

-

전체자료 30개

인슐린 자료조사

< 인슐린 자료조사 >1) 인슐린 정의 및 구조* 정의: 섬이란 뜻의 라틴어인?insula에서 유래되었다. 인슐린을 분비하는 세포는 랑게르한스섬(Langerhans’ island)의 β-cell이다. 단백질 중에서는 최초로 구조식이 밝혀진 것으로, 두 개의?아미노산 사슬이?S-S결합(이황화결합)으로 연결되어 있다. 1921년 캐나다의 의사?F.?G.?밴팅과?C.?H.?베스트에 의하여 처음으로 이자에서 채취되었고, 그 후 인슐린의 결정을 얻게 되었다.?F.?생거에 의해서 소의 인슐린의 구조가 밝혀졌다(1955).* 구조: 인슐린(insulin)은 췌장의 베타세포(β-cell)에서 분비되는 펩티드 호르몬으로 21개의 아미노산으로 된 A사슬과 30개의 아미노산으로 된 B사슬이 2개의 이황화물 결합(S-S 결합, disulfide bond)에 의해 연결된 구조이다. 인슐린은 초기에 더 긴 단일 사슬로 구성된 펩티드 전구호르몬인 전구인슐린(proinsulin)으로부터 31개의 아미노산으로 된 C-펩티드가 분리되면서 형성되었다. 인간의 인슐린 분자량은 5807Da(g/mol)이다.(S-S 결합: 이황화물 결합, 2개의 SH기가 산화되어 생성하는 -S-S 형태의 황 원자간 결합. 단백질의 이황화물 결합은 2분자의 시스테인이 산화되어 형성되는 것)* 역할: 음식을 섭취하면 인슐린이 혈액 내로 분비되어 혈액 속의 당분(포도당)을 몸속의 여러 장기에서 이용할 수 있도록 에너지를 생성시켜 혈당을 일정하게 유지하는 역할을 할 뿐만 아니라 과다한 당을 간에 저장하는데 도움을 주며, 우리가 섭취하는 주요 영양소인 지질과 단백질의 대사에도 중요한 역할을 수행한다.인슐린의 작용으로 혈당치를 내리는 기능이 있다. 혈중 인슐린의 농도가 증대하면 수분 이내에 지방세포, 근육세포의 포도당 흡수가 증가하여 혈중 포도당량이 저하한다. 간세포에서는 포도당의 흡수와 글리코겐으로의 합성을 촉진하고 지방조직에서는 지방의 분해를 억제하며 근육조직에서는 당의 이용을 촉진한다.=> 인슐린이 부족하여 생기는 인슐 >출처: https://www.slideshare.net/joyunuse/industrial-production-of-insulinppt 14페이지부터① Bio reactor fluid with cells (유전자 재조합된 cell 키우기): Bioreator를 이용하여 프로인슐린이 들어있는 플라스미드를 지닌 박테리아를 키운다. in test tubes containing tryptic soy broth & kanamycin monosulphate.사진에 나와 있는 각 파라미터 값들은 최대 cell growth와 인슐린 생산을 위한 것이다.② 세포 파쇄 및 균질화(disruption & Homogenization)③ 원심분리를 이용한 봉입체(inclusion body) 분리그림만 ppt에 넣고 옆에 영어설명은 그냥 말로 설명해도 좋을 듯.=> supernatant(상층액)을 추출한다.④ Dialysis, 봉입체(inclusion body)와 박테리아 세포를 분리하여 정제하는 과정박테리아 세포와 봉입체가 함께 반투과성 막 장치로 공급된다. 이 때 분자 무게가 낮은 물질이 막을 가로질러 이동하는 동안 박테리아세포가 걸러진다. 하지만 이 과정에서 proinsulin의 손실이 일어날 수도 있다.< Part 2: CNBr 이용하여 프로인슐린 분해.: Diagrammatic representation of the proinsulin fusion protein. The polyhistidine tag is cleaved from proinsulin by CNBr. Note that this diagrammatic representation depicts proinsulin with correctly linked disulfide bonds. These bonds have likely not formed when proinsulin is still attached to the polyhistidine tag. The sites of normal post-translatioof cyanide gas is formed as a by-product of the cleavage reaction. Detailed information on CNBr cleavage is available in the patent literature (U.S. Patent No. 4,451,396, 1984.). The formic acid, unreacted CNBr, and generated cyanide gas are removed by applying vacuum and raising the temperature to around 35 oC (the boiling point of CNBr). This operation is carried out in a rotary vacuum evaporator (CSP-101) and takes 1 h. Since cyanide gas is toxic, all air exhausted from the vessels is scrubbed with a solution of hypochlorite, which is prepared and maintained in situ (Kehoe, 1989).< Part 3: Sulfonation (Sulfitolysis) >Sulfitolysis. Sulfitolysis of the denatured proinsulin takes place in a reaction tank (V-105) under alkaline conditions (pH 9-11). This operation is designed to unfold proinsulin, break any disulfide bonds, and add SO3 moieties to all sulfur residues on the cysteines. The product of interest is human proinsulin(S-SO3-)6 (protein-S-sulfonate). The sulfitolysis step is nen, the sulfitolysis solution is exchanged with WFI to a final guanidine?HCl concentration of 20% w/w. This procedure, P-21, utilizes the DF-101 diafilter that also handles buffer exchange after IB solubilization. The human proinsulin(S-SO3-)6 is then chromatographically purified using three ion-exchange columns (C-101) operating in parallel. Each column has a diameter of 140 cm and a bed height of 25 cm. A cation exchange resin is used (SP Sepharose Fast Flow from GE Healthcare) operating at pH 4.0. The eluant solution contains: 69.5 % w/w WFI, 29% urea, and 1.5% NaCl. Urea, a denaturing agent, is used to prevent incorrect refolding and cross-folding of proinsulin(S-SO3-)6. The following operating assumptions were made: (1) the column is equilibrated for 30 minutes prior to loading, (2) the total resin binding capacity is 20 mg/ml, (3) the eluant volume is equal to 5 column volumes (CVs), (4) the total volume of the solutions for column wash, regeneration and storage is 15 CVs, and (5)e refolding step, the refolding reagents are replaced with WFI and the protein solution is concentrated using a diafiltration unit (DF-103), which has a product recovery yield of 95% (5% of the protein denatures). The volume of the solution at this point is around 5000 L. Next, the human proinsulin is chromatographically purified in a hydrophobic interaction chromatography (HIC) column (C-102). The following operating assumptions were made: (1) the column is equilibrated for 30 minutes prior to loading, (2) the total resin binding capacity is 20 mg/ml, (3) the eluant volume is equal to 6 column volumes (CVs), (4) the total volume of the solutions for column wash, regeneration and storage is 15 CVs, (5) the protein of interest is recovered in 1 CV of eluant buffer with a recovery yield of 90%, and (6) the material of a batch is handled in three cycles.=> 대장균에서의 환경에서 인슐린이 아예 접히지 않았거나 CNBr처리과정에서 이황화물 결합이 제대로 안되어있는 상태에서는 원하는 인슐린을 얻을 수 없으므로 Sulfination으로 잘못된 이황화물 결합들을 아예 깨거나 접힘을 풀어버린다. 그 후 39

공학/기술| 2019.09.26| 12페이지| 1,500원| 조회(267)

인슐린, 공정도, 자료조사

미리보기

닫기
인슐린 평가D별로예요

Recovery Purification of Human InsulinContents 1 Human Insulin 2 Process introduction 3 Process Design 4 Reference 2Human Insulin * 췌장의 (β-cell) 에서 분비 *21 개의 아미노산으로 된 A 사슬과 30 개의 아미노산으로 된 B 사슬 2 개의 이황화물 결합 (S-S 결합 , disulfide bond) * 혈당 일정 유지 , 당 저장 3 Human Insulin 이란 ? 1Process Introduction 4 Recovery Purification of Human Insulin 2Process Introduction 5 Bioreaction 2Process Design 6 1.Bioreactor fluid with cells 3 *Parameters Fermentation time 31hr Temperature 약 37 ℃ pH 7 발효가 끝날 때 쯤 세포 파괴를 최소화하기 위해 배지의 온도를 10 ℃로 낮춤Process Design 7 2.Cell disruption-Homogenization 3 A. 균질화 장치는 고압 , 고속 흐름을 노즐밖으로 내보낸다 . B. 흐름은 300ft/s 의 속도로 블레이드를 향해 흘러간다 . C. 블레이드는 세포를 파쇄 시키며 내용물을 분산시킨다 .Process Design 8 3.Centrifugation Extraction 3 박테리아 세포와 봉입체를 분리시키는 단계 . Centrifusion이 적용되면 중력보다 큰 힘이 원심분리의 가운데에 적용 되어 밀도가 높은 입자들 ( 봉입체 )이 바닥으로 밀려난다 .Process Design 9 4.Dialysis 3 이 프로세스의 재구성은 용해 시약의 매우 희박한 몰농도를 포함한 버퍼 (ex. Tris-HCL) 에 대해 흡수된 fusion- 단백질 용액을 투석하여 효과적으로 수행된다 .Process Design 10 5.Cleaning pro-Insulin 3 * CNBr (cyanogen bromide) Cleavage - proinsulin 과 결합 단백질을 이어주는 peptide linker 를 쪼개기 위해 cleavage step 에서 CNBr 과 70% formic acid 을 투입한다 . - CNBr 은 chimeric protein 을 signal sequence Trp -LE'-Met(121 개 아미노산 ) 과 변성된 proinsulin(82 개 아미노산 ) 으로 쪼갠다 .Process Design 11 6.Sulfonation Refolding 3 *Sulfonation 유기 화합물 분자 중에 설폰산기 (SO 3 H) 를 도입하여 RSO 3 H 형의 화합물을 생성하는 반응 탄화수소에 진한 황산 , 발연 황산 등을 작용시켜 치환반응을 한다 . *Refolding 안정한 이황화물 결합으로 인슐린을 제대로 접는다 .Process Design 12 8.Dialysis 3 앞의 과정에서 사용된 변성제과 가용화 시약을 제거하기 위함 . 이후 Renaturation 을 통해 안정한 결합 형태를 극대화시킨다 .Process Design 13 9. precipitation A chain B chain 3 pH 를 6 으로 조절하기 위해 ZnCl2 첨가 8℃ 로 최소 6hr 유지 5000rpm 으로 원심분리 Drying of pellet 이온 교환 크로마토 그래피 및 침전에 대한 수율 ; 약 75 %Process Design 14 10. Chromatography A chain B chain 3참고문헌 http://www.madehow.com/Volume-7/Insulin.html#ixzz5odUcCGSM https://terms.naver.com/entry.nhn?docId=2841307 cid=56739 categoryId=56739 https://www.slideshare.net/joyunuse/industrial-production-of-insulin http://1.droppdf.com/files/cJaVs/encyclopedia-of-bioprocess-technology.pdf http://www.sciencedirect.com.ssl.glibproxy.gachon.ac.kr:8080/science/article/pii/S10*************2?via%3Dihub 15Q A 16{nameOfApplication=Show}

공학/기술| 2019.09.26| 16페이지| 1,500원| 조회(357)

인슐린, insuline, Human Insulin

미리보기

닫기
아모레퍼시픽 품질관리 합격자기소개서 평가A+최고예요

1. 아모레퍼시픽 그룹은 아름다움으로 세상을 변화시키겠다는 특별한 소명을 가지고 있습니다.세상을 변화시키는 '아름다움이 왜 필요한지 정의'하고, 입사한다면 이러한 소명을 어떻게 실현 할 수 있을지 기술하시오. (필수입력사항 최대 800 최소 200)내용을 입력해주세요.0/800[모두가 잘 살기 위한 세상]더불어 사는 세상에서 우리에게 가장 필요한 것은 ‘아름다움’이라고 생각합니다. “아름다움 이란 무엇이다”라고 정확히 규정 할 수는 없을 것입니다. 하지만 이해인 수녀의 의 시의 한 구절 “나 하나 꽃 피어 꽃밭이 달라지겠냐고 말하지 말아라. 네가 꽃피고 내가 꽃 피면 결국 꽃밭이 온통 꽃밭이 되는 것 아니겠느냐?”에서 보듯이 ‘아름다움’은 사랑을 베풀며 그것을 공유함에서 시작되는 것이라고 생각합니다. 이러한 ‘아름다움’의 공유를 통해 모두가 행복해지는 이상향을 추구할 수 있으므로 ‘아름다움’은 우리 삶에 있어서 필수 불가결한 것이라고 생각합니다.이러한 베풂은 굳이 방대한 것에서 의미를 두지 않더라도 소소한 것부터 실천할 수 있습니다. 저는 유니세프에 적은 돈이지만 매달 일정 금액 20,000원을 후원하면서 어려운 아이들에게 희망을 나누려는 노력을 하고 있습니다. 이를 통해 그들의 삶이 조금이라도 행복해졌다면 이것이야말로 작지만 아름다움으로 세상을 변화시킨 것이라고 할 수 있을 것입니다.입사 후 아모레퍼시픽의 품질관리 엔지니어로서 쌓은 재능을 ‘아름다움’이라는 이름으로 사회에 환원하겠습니다. 더불어 사는 세상을 만들기 위한 사회공헌활동과 기능봉사활동을 활기차게 진행하여 전 세계 고객들에게 아름다움을 제공하겠습니다. 이러한 아름다움을 공유함으로써 아모레퍼시픽의 이미지 향상에 기여하여 두 마리의 토끼를 잡도록 하겠습니다.2. 현재 귀하의 가장 부족한 역량은 무엇이며, 역량개발을 위해 어떤 활동과 노력을 하고 있는지 기술하시오. (필수입력사항 최대 600 최소 200)내용을 입력해주세요.0/600[창의적인 도전정신을 기르다]제품의 품질을 담당하는 엔지니어로서 고객 만족을 위한 창의적인 도전정신이 필요하다고 생각합니다. 또한, 신입사원은 배움을 통해 실전에 적용하는 능력을 쌓아야 한다고 생각합니다. 실전을 통한 창의적인 도전으로 회사의 매출을 올린 경험이 있습니다.제과점 아르바이트 시절, 회사는 열악한 재고관리 프로그램을 사용하였습니다. 그래서 물량이 많은 크리스마스 기간에는 고객의 complain이 많이 생겼습니다. 저는 ‘고객 만족을 통한 매출향상’이라는 확고한 목표를 세우기 위해 공학 교육혁신센터강의에서 배운 내용으로 창의적인 프로그램 제작에 도전하였습니다. 프로그램 명령어 사용이 익숙지 않아 제작에 많은 고충을 겪었지만, 관련 서적을 참고하여 효율적인 프로그램을 제작하였습니다. 프로그램을 활용하여 회사는 빠른 재고처리 속도로 고객만족도 향상과 더불어 전년 대비 매출액 140%를 달성했습니다.이를 통해 업무는 배움에서 끝나는 것이 아니라 도전을 통한 숙달이 중요하다고 느꼈습니다. 아모레퍼시픽에 입사 후에도 배움을 바탕으로 창의적인 도전으로 업무를 수행하도록 노력하겠습니다.

취업| 2018.07.03| 2페이지| 3,000원| 조회(707)

자기소개서, 품질관리, 자소서, 아모레퍼시픽, 면접, 기본, QC, 합격, QA, Qm

미리보기

닫기
Plasmid DNA Isolation 실험-예비,결과,레포트,보고서 평가A+최고예요

Plasmid DNA isolation실험 보고서실험 11. Plasmid DNA isolation1. 실험의 목적- 형질전환된 E. Coli 내에 있는 플라스미드 DNA를 분리해 낸다.- 플라스미드 DNA에 대한 이해와 Kit를 사용한 분리 정제법을 배운다.- E Coli를 배양 후, Plasmid DNA를 추출하고 Nano Drop (Spectrometer)으로농도를 측정한다.2. 사용 시약 및 기구a. 시약Bioneer AccuPrep Plasmid Extraction Kit(K-3030-1)Resuspension buffer (RS), Rnase A powder, Lysis buffer(BL),Neutralization buffer(NE), Denaturation buffer(DE), Elution buffer(E)DNA-binding column tube, 2ml tube for filtration, 1.5ml tube for elutionAbsolute ethanol얼음b. 기구Microcentrifuge tube (1.5 mL)Table-top microcentrifuge 10,000 x g (13,000 rpm)thermal blockc. 준비· Resuspension buffer에 RNase A powder 를 넣는다. (15ml/1.5mg)· Denaturation buffer에 에탄올을 섞는다.(18ml/ 10.8ml)· 80%(v/v) Ethanol 준비· Elution buffer는 용리 효율을 높이기 위해서 60℃로 예열하여 놓는다.3. 실험방법 및 실험방법에 대한 고찰① 세균에서 plasmid DNA를 분리하려면 먼저 세포를 많이 키워야 한다. 배양접시에 자란colony를 멸균한 이쑤시개로 picking하여 shaking incubator에서 하루밤동안 배양한다. 이 액체 배지에는 ampicillin이 함유되어 있다.② 배양액체배지 1.5 ml를 micro-centrifuge tube에 옮겨 담고 1분간 상온에서 12,000 rpm으로 원심분리한다.③ 상층액을 제거한 후 배양액체배지 1.5 ml를 다시 첨가 및 원심분리를 몇 차례 반복해서 cell을 충분히 모은다.④ 침전된 균에 Resuspension buffer 250 ㎕ 넣고 vortex하여 균을 완전히 풀어준다.- Resuspension buffer 에는 glucose와 EDTA가 들어있는데, EDTA는 세포막을 파괴하기 쉬운 상태로만들어주는 역할을하고, glucose는 glucose는 cell wall이 깨지지 않게 하여 삼투압을 유지하게 한다.⑤ Lysis buffer를 250 ㎕넣고 5~6회 inverting하여 섞은 후 5분간 상온에서 방치한다. (vortex 금지)- Lysis buffer에는 SDS라는 계면활성제가 있어 세포막을 파괴시키고, NAOH가 들어있어서 세포안에 들어있는 DNA와 ligation된 Plasmid를 변성시킨다.⑥ Neutralization buffer를 350 ㎕ 첨가하고 튜브를 5~6번 inverting한 후 4°C에서 5분간incubation 한다.- Neutralization buffer는 Lysis buffer로 인해 변성된 플라스미드와 DNA를 중화시켜주는데 그로인해 플라스미드는 변성되었던 상태에서 원래의 모습으로 복구되게 된다. 하지만 DNA는 크기로 인해 단백질과 엉키게 되어 더욱더 복잡한 구조를 갖게 된다.⑦ 4°C에서 12,000 rpm, 10분간 원심분리 한다.-원심분리하여 DNA와 단백질이 엉킨 복합물을 침전시킨다.⑧ 상층액을 조심스럽게 떠서 Binding column tube에 옮기고 12,000 rpm에서 1분간 원심분리해서 filtrate를 버린다.-플라스미드가 포함된 상층액을 Binding column tube에 옮기고 원심분리시키고 하층액(DNA와 단백질이 엉킨 복합물)을 버린다.⑨ 500 ㎕ Denaturation buffer를 첨가하고 5분간 incubation 후 원심분리한 후 filtrate를 버린다. (12,000 rpm, 1 min)-Denaturation buffer는 플라스미드가 Binding column tube의 silica membrane에 잘 부착 될 수 있도록 플라스미드가 잘 침전되게 도와주는 역할을한다.⑩ 700 ㎕ 의 80% EtOH를 첨가하고 원심분리한 후 filtrate를 버린다.(12,000 rpm, 1 min)-에탄올을 첨가해 불순물을 제거해준다.⑪ 13000 rpm에서 1분간 원심분리해서 drying 시킨다.⑫ 1.5 ml 의 collection tube 로 바꾸어주고 column에 EL buffer 100 ㎕ 를(60℃로 예열)첨가하고 buffer가 완전히 glass filter에 흡착되도록1분간 incubation 한다.-elution buffer를 넣어줌으로써 Binding column tube의 silica membrane에 부착된 플라스미드가 silica membrane에서 나올 수 있게 해준다. filtrate에 플라스미드가 원심분리되어 나오게된다.⑬ 13,000 rpm 으로 1분간 원심분리한다.⑭ column을 제거하고 collection tube sample (약 90 ㎕ ) 을 -20℃에 보관한다.⑮ nano-drop으로 Plasmid DNA의 농도를 측정한다.4. 실험 결과 및 고찰우리는 이전 실험에서 플라스미드가 삽입되어 형질 전환된 세포를 얻었었고, ecoli세포내에 형질전환으로 삽입된 플라스미드를 다시 플라스미드만 분리시키는 실험을 오늘 진행하였다.플라스미드를 정제하는 방법으로는 Kit를 이용한 실험인데, 앞선 시험들과 같이 kit로서는Resuspension buffer ,Lysis buffer, Denaturation buffer, Neutralization buffer, Elution buffer등의 버퍼가 사용된다,기본적인 실험의 원리로서는 Resuspension buffer 와 Lysis buffer를 사용해서 세포막을 파괴하고, lysis buffer에 포함된 NAOH가 DNA와 플라스미드를 변성시키게 된다. 이때 DNA는 이중나선구조가 파괴된다고 한다. 그리고 Neutralization buffer를 첨가하여 중화를 시켜주게 되면, DNA는 크기 때문에 단백질과 엉킴 현상이 일어나서 복잡한 구조를 띠게 되고, 플라스미드는 변성되었던 모습에서 본래의 모양을 되찾는다. 그리고 이후에 binding column에 옮겨주고 원심분리 시키면 상층액과 silica membrane에는 플라스미드가 남고, 하층액에는 DNA와 단백질의 엉킨 복합물이 남게된다.이러한 원리와 과정을 거쳐서 세포내에서 플라스미드만을 분리해낼 수 있게 되는 것이다.이렇게 정제된 plasmid를 얻은 후에 우리는 다음실험으로 제한효소를 이용하여 우리가 처음에 ligation 했던 부분의 유전자를 다시 잘라내어서 전기 영동시켜서 우리가 형질 전환시킨 유전자가 , ligation 해주었던 유전자가 정확히 우리가 넣어준 유전자가 맞는지 확인 할 수 있게 된다.나노드랍 측정이후의 우리의 실험결과 값이다. 농도가 적절하게 나왔고 불순물 비율도 나쁘지 않기 때문에 플라스미드가 좋은 농도로 측정되었다 ( 정제되었다) 라고 할 수 있다.5. 참고사항1) 형질전환어떤 균의 유전 형질의 일부를 다른 균에게 이동하여 일어나는 유전교잡의 한 형태로 공여 균에서 추출한 DNA를 직접 수용균주에 도입시켜 유전자 조합이 일어나 유전적 형질이 변 화하는 것을 말한다. 적당한 vector를 사용하는데 이번 실험에서는 Plasmid DNA가 그 vector이다. 우리는 항생제인 ampicillin에 대한 저항성이 있는 대장균을 사용할 것이기 때 문에 Plasmid를 이용한 형질전환을 통해 대장균을 ampicillin 저항성 유전자를 가지게 하 였다.2) Ampicillin을 함유한 액체 배지를 사용하는 이유ampicillin은 항생제의 종류 중 하나이다. plasmid DNA를 가지고 있는 대장균은 Plasmid DNA에 항생제 저항성 유전자가 존재하는데 여러 가지 항생제 중에 ampicillin에 저항하는 유전자도 존재한다. 따라서 ampicillin을 액체배지에 첨가해 다른 세균들을 죽이 고 Plasmid DNA를 가지고 있는 대장균만을 추출할 수 있다.3) E.coli (Escherichia coli, 대장균)그람음성의 호기성~통성혐기성의 간균이다. 아포가 없고 편모를 갖는다. 대장균은 열에 대 한 저항성이 약하여 60℃에서 약 20분간 가열하면 멸균된다. 대장균은 배양하기 쉽고 세균 의 접합현상(conjugation), 파지(Phage)에 의한 형질도입 등 원핵생물이면서 유전적 해석이 되기 때문에 분자생물학과 생물공학의 연구 재료로서 널리 이용되어 왔다.4) 원심분리원심력에 의해 액체중의 고체입자 또는 액체미립자을 분리하는 조작이다. 특히 침강분리, 탈수, 여과 등의 기계적 분리시에 잘 사용된다. 중력에 비하여 대단히 큰 분리력이 얻어지 기 때문에 분리가 곤란한 미립자나 밀도차가 대단히 작은 성분의 분리에 사용된다. 밀도가 작은 성분은 실린더의 안쪽(위쪽)으로 밀도가 큰 분자는 실린더의 바깥쪽(아래쪽)으로 분리 가 된다.5) spectrometer(분광기)물질이 방출 또는 흡수하는 빛의 스펙트럼을 계측하는 장치이다. 이러한 성분 계측방법을 분광광도법이라고 한다. 준비된 시료에 빛을 쏴 목적 성분의 흡광도를 계산해 그 목적 성분 의 양을 알아내는 방법이다. 흡광도를 계산하는 방법은 아래와 같다.I _{t} =I _{0} ```` BULLET 10 ^{-EC`l}

공학/기술| 2018.06.27| 11페이지| 1,000원| 조회(1,561)

레포트, 보고서, 예비, 결과, 매우자세히

미리보기

닫기
Micro-Capilary electrophoresis(MCE)실험 - 예비,결과,레포트,보고서 평가A+최고예요

실험 보고서Micro-capilary electrophoresis1. 실험 제목Micro-capillary electrophoresis2. 실험 목적- 이전 실험에서 추출된 DNA를 MCE 칩으로 분리하여 크기와 농도를 측정한다.- MCE 칩의 원리와 Bioanalyser 사용법을 익힌다.- MCE 결과와 Agarose gel 전기영동 결과와 비교한다.3. 실험 원리 및 이론(1) 전기영동 (Electrophoresis)수용액 상에서 많은 분자들은 +전하나 ?전하를 띠고 있다. 이 때, 전기를 흐르게 하면 각 분자들은 반대 전하를 가진 전극으로 이동하게 된다. 이를 이용하여 혼합물을 분리하는 방법을 전기영동이라고 한다.[그림 1] (a) 전기영동의 원리 (b) 전기영동을 사용한 DNA의 분리DNA를 분리하는 경우에는 한천(agarose)을 gel로써 사용한다. 음전하를 띠고 있는 DNA는 전기를 흐르게 하면 양(+)극으로 이동하며 그물망 구조의 한천 그물망의 방해를 받는다. 크기가 큰 DNA는 작은 DNA에 비해 이동하기가 어렵고, 이를 이용하여 DNA를 크기순으로 분리할 수 있다.(2) MCE [Micro-capillary electrophoresis (모세관 전기영동)]전기를 걸어주어 시료성분이 전하와 이동도에 따라 각각 일정한 방향과 속도로 이동하여 시료를 분리해내는 전기영동법의 원리를 모세관에 적용시켜 물질을 분리하는 방법이다. 전기영동법과 고성능 액체 크로마토그래피가 가지고 있는 높은 효율, 빠른 분석시간, 적은 시료 소요량 그리고 전하에 관계없이 모든 용질을 동시에 분석할 수 있는 장점을 가진 모세관 전기영동법은 현재 필수적인 분석 기술로 자리 잡고 있다.[그림 2] 모세관 전기영동기의 구조MCE는 아주 가느다란 관, 즉 모세관에서 수행되는 방법으로 실리카로 된 모세관은 길이가 약 20～30 cm이고 지름(두께)은 약 50～100 ㎛정도이다. 검출기는 시료 주입부의 반대편 모세관이 끝나는 지점에 위치하여 모세관 내에서 충분히 분리된 시료를 측정한다.성전하, 음전하 순으로 이루어진다. 구조상 인산에 의해 음전하를 띠는 DNA의 검출시에는 시료를 (-)전극 쪽 모세관에 주입하여 (+)전극으로 이동하며, 이 때 DNA의 길이에 따라 이동속도가 달라 그 차이를 이용하여 DNA의 크기 및 농도를 확인할 수 있다. (b)는 MCE 분석 예시로 빨간 색은 ladder peak로 이미 우리가 알고 있는 크기의 DNA를 나타낸 것이다. 파란색과 초록색 peak는 분석하기 위하여 넣어주었던 DNA의 peak로 빨간색의 ladder peak와 비교하여 DNA의 크기를 알 수 있으며, peak의 높낮이로 농도를 알 수 있다.(3) MCE 원리MCE는 적당한 전해질 완충용액이 채워진 모세관의 양 끝이 완충용액에 담겨있고 고전압을 이용하여 모세관 양 끝에 전장을 걸어준다. 전하를 띈 용질이 완충액을 통과하여 나오는 것을 모세관의 끝에 있는 검출기에서 감지하게 된다.모세관에서 이온을 띈 물질이 분리되어지는데 기여하는 유체의 움직임이 2가지가 있다.① 전기이동적 흐름 ( Electrophoretic flow )전기이동이란, 전하를 띈 용질이 반대 전하 전극으로 이동하는 것을 말하며 전기이동에 의한 분리는 근본적으로 전기장 내에서 용질의 속도차이를 이용한 것이다.` upsilon _{e} = mu _{e} TIMES E= mu _{e} TIMES V/L`upsilon _{e}전기이동속도mu _{e}전기이동도E전기장V걸린 전압L모세관 길이` mu _{e} = {q} over {6 pi eta r} `q이온화된 용질의 전하& eta 완충용액의 점도r이온의 반경이 식으로부터 크기가 작고 큰 하전을 띤 용질이, 크기가 크고 작은 하전을 띤 용질보다 빨리 이동함을 알 수 있다.② 전기삼투적 흐름 ( Electroosmotic flow )유체가 항상 일정한 방향으로 움직이게 하는 힘이다. 모세관 내의 큰 흐름으로 모세관 내벽 표면전하 때문에 생긴다. 모세관은 실리카(silica)로 이루어져 있어 실라노기(-SiOH)에 의해 수용액 중에서 음전하Ladder,(green) DNA 7500 Markers (50, 10000 bp), (blue) DNA Dye Concentrate, (red) DNA Gel Matrix, Spin filter]Syringe Kit (1 Syringe)b. 기구Agilent 2100 Bioanalyzer, Chip Priming Station, Vortex mixerMicrocentrifuge tubes : 0.5 ㎖ for sample preparation, 1.5㎖ for gel-dye mix preparation.Microcentrifuge, micro pipet and tips (10, 100, 1000 ㎕)c. 준비- chip priming station과 bioanalyzer를 사용할 수 있게 준비한다.- 새로운 DNA lab chip kit를 사용할 때마다 Chip Priming Station에서 syringe를 교체한다.- Chip priming station의 base plate와 syringe clip을 칩종류에 따라서 조절한다.- bioanalyzer의 칩 selector를 double strand DNA로 선택한다.- 실험을 하기 전과 끝난 이후에는 반드시 증류수로 Agilent 2100 Bioanalyzer 전극 부분을 세척해 주어야 한다.- 이 실험에서 사용되는 형광염료는 빛을 받으면 효율이 떨어지므로 꼭 빛을 차단한 용기에 담아 두어야 한다.- Gel-dye mix를 미리 만들어 놓은 것이 있다면 상온에서 30분 동안 안정화 시키고, 1시간 이상 사용하지 않을 시에는 4℃에 보관한다.1. 실험방법3-1. Gel-dye mix 만들기① DNA Dye Concentrate (blue)와 DNA Gel Matrix ( red)를 상온에서 30분 동안 안정화 시킨다.② 1.5㎖ micro-centrifuge tube에 DNA Gel Matrix ( red) 400㎕ 와 DNA Dye Concentrate (blue)를 20㎕ 를 넣고 voltexing 한 (green)를 5㎕ 씩 나머지 well에 다 넣는다.⑧ DNA 7500 Ladder (yellow)를 tapping 후 spin down 하여 취한 뒤1㎕를 Ladder symbol well에 넣는다.⑨ 준비된 개수만큼의 샘플을 1㎕ 씩 넣는다. 샘플을 넣지 않는 부분은 증류수 1㎕을 넣는다.⑩ vortex mixer에 chip을 넣고 60sec동안 2400 rpm 으로 vortexing한다.⑪ Electrode cleaner에 D.I Water 350㎕를 넣고 Agilent 2100 Bioanalyzer에 넣는다.⑫ chip을 vortex mixer에서 꺼내고 Electrode cleaner를 뺀 후 Agilent 2100 Bioanalyzer에 넣는다.⑬ 컴퓨터에서 2100X pert를 클릭하여 프로그램을 작동시키고 DNA 7500을 선택한 뒤,Assay-Electrophoresis-dsDNA-DNA7500을 클릭, file name 지정, 샘플개수지정, start⑭ chip run이 끝나면 End of Run 메시지가 나온 뒤 칩을 꺼낸다.⑮ Electrode cleaner에 D.I Water 350㎕를 넣고 Agilent 2100 Bioanalyzer에 넣어 세정한다.? chip run data 분석은 Data and Assay context를 선택하여 Gel or Electropherogram 분석한다. ladder가 12개 peak를 보이지 않을 때는 다시한다.5. 결과 및 고찰1. 실험 결과그림 - Agilent 2100 Bioanalyzer 으로 측정한 전기영동 결과우리는 1044 Base pair를 가진 HPRT1 중 일부분의 유전자를 증폭 시켰었다.실험 결과 농도가 높게 나오진 않았지만 원하는 Base pair와 비슷한 크기를 가진 DNA가 검출 됬다는 것을 확인 할 수 있었다.2. 토의 및 고찰(1) 실험 과정에 대한 고찰① Gel-dye mix는 쓰기 전에 30분 동안 안정화 시킨다. (빛 차단)I . 역할 : 무색인 DNA을 염색하여에 넣는다.DNA 7500 Ladder - 우리가 원하는 peak가 몇 Base pair인지 알 수 있게 해주는 시약⑩ vortex mixer에 chip을 넣고 60sec동안 2400 rpm 으로 vortexing한다.Gel-dye mix, DNA 7500 Markers, DNA 7500 Ladder 시료들을 vortexing 과정을 통해 잘 섞어 준다.⑪ Electrode cleaner에 D.I Water 350㎕를 넣고 Agilent 2100 Bioanalyzer에 넣는다.실험을 하기 전과 끝난 이후에는 반드시 증류수(D.I Water)로 Agilent 2100 Bioanalyzer 전극 부분을 세척해 주어야 한다.⑮ Electrode cleaner에 D.I Water 350㎕를 넣고 Agilent 2100 Bioanalyzer에 넣어 세정한다.실험을 하기 전과 끝난 이후에는 반드시 증류수(D.I Water)로 Agilent 2100 Bioanalyzer 전극 부분을 세척해 주어야 한다.(2) 실험 결과에 대한 고찰그림 - Agilent 2100 Bioanalyzer 으로 측정한 전기영동 결과이번 실험은 모세관 전기영동으로 겔 추출 하여 얻은 DNA를 사용하여 MCE 칩으로 분리하여 크기와 농도를 측정해보고 MCE칩의 원리와 Bioanalyser 사용법을 익히는 것이었다.MCE의 간단한 원리는 다음과 같다. 먼저 DNA를 포함한 시약을 MCE의 모세관이 빨아 들이게 되면 MCE의 모세관은 음전하를 가진 silica membrane으로 이루어져 있고, 모세관 안에는 gel matrix 구조가 형성되어 있다. 따라서 모세관에 전압을 가해주게 되면 DNA의 크기에 따라서 움직이는 속도가 달라지게 되고, 일정한 구역에서 DNA가 흡수하는 파장의 UV인 약 260nm를 조사해 주게 되면 흡광도가 증가하게 되는데 이런 흡광도가 증가하는 정도와 측정되는 시간에 따라서 DNA의 Base pair의 크기와 DNA의 농도를 알아 낼 수 있는 분석법이다.모세관 전기영동은 적은

공학/기술| 2018.06.27| 15페이지| 2,000원| 조회(1,132)

레포트, 보고서, 예비, 결과, 매우자세히

미리보기

닫기