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예방약학 생체방어기작 연구(A+ 받은 레포트)

예방약학 - 생체방어기작 연구Ⅰ. Introduction생명체는 외부의 이물질 특히, 세균 및 바이러스와 같은 감염성 질환을 동반하는 병원체로부터 질병에 걸리지 않기 위한 방어 기작을 가지고 있는데, 이처럼 내인성 혹은 외인성 이물질인 항원에 대하여 숙주 내에서 일어나는 일련의 반응을 면역 반응이라고 한다. 면역 반응은 크게 선천 면역(innative immune response)과 후천 면역(adaptive immune response)으로 나뉘는데, 선천 면역은 감염에 대한 1차적인 방어선을 제공해 준다. 후천 면역처럼 특정 병원체(항원)를 기억하여 특이적으로 반응하지 않고, 비특이적이고 포괄적인 방법으로 병원체를 제거한다. 대신에 후천 면역에 비해 즉각적으로 반응하여 신속하게 병원체에 대한 저항성을 나타낸다는 점이 장점이다. 선천면역에 관여하는 세포들은 감염되기 전부터 우리 몸 속에 존재하고 있으며 특이성을 가지지 않는 질병억제 기작을 담당한다. 대식세포들 및 중성구들과 같은 식세포들, 피부와 같은 장벽들, 그리고 체내의 항생물질 등이 내재 면역에 중요한 역할을 한다.선천 면역에도 여러 가지 종류가 있지만 그 중에서도 감염에 대비한 대표적인 생리학적 반응을 꼽으라면 TLR(Toll-like receptor)에 의한 면역 반응이라 할 수 있다. TLR은 세균, 바이러스, 기생충 등의 병원체에 대한 초기단계의 생체방어의 자연면역에서 병원체를 구성하고 있는 성분의 특유한 분자패턴을 직접, 인식(pattern recognition)하는 수용체를 말한다. 특히 당지질인 LPS는 병원성 미생물(그람 음성균)에서만 특징적이고 다세포 생물에서는 발견되지 않는데, 이러한 분자들이 표현되는 병원체를 즉시 인지하고 반응을 보이는 것이 TLR4이다. 따라서 숙주에 그람 음성균이 국소적으로 감염 되면 TLR4는 침입한 세균을 격퇴하는 역할을 하게 된다. TLR3은 바이러스의 두가닥 RNA(dsRNA)를, TLR5는 세균의 편모단백질인 플라젤린(flagellin)을 인식한다. T Method1. isolation of bone marrow cell쥐의 허벅지와 정강이 뼈에서 bone marrow cell을 추출한다.2. cell seeding① Well 1,2 (2개 well)에 각각 WT BMDM 2×106 cells씩 넣어준다. (1.5ml)1) 배지에서 배양되고 있는 cell을 준비한다.2) 배지는 빼내고 5ml의 PBS로 세척 후 버린다.3) Trypsin을 1ml 넣어서 부착단백질을 잘라준다.4) 배지 10ml를 15 conical tube에 담은 뒤 원심분리 시켜준다.5) 원심 분리 후 가라앉은 cell을 제외한 trypsin+media는 버리고 새로운 media를 10ml 넣어 주고 cell을 풀어준다.6) 세포액20ml에 trypan blue 60ml를 넣은 뒤 cell을 counting한다.② Well 3,4 (2개 well)에 각각 IKKi 유전자가 KO된 BMDM 2×106 cells씩 넣어준다. (1.5ml) (→조교님이 해주셨다)3. 자극 물질 및 약물처리① Treat1) DMEM media, LPS stock(50㎕/ml), Endotoxin free water가 준비되어 있는지 확인.2) 5ml tube 2개를 준비한다.3) Tube 1 - Endotoxin free water 4 ㎕와 DMEM media 2ml을 순서대로 넣어준다.Tube 2 - LPS stock 4㎕와 DMEM media 2ml을 순서대로 넣어준다.4) 각 tube를 2~3초 vortexing하여 잘 섞어준다.5) 전날 seeding한 plate의 media를 제거한다.6) 각각의 tube의 media를 해당 well에 800㎕씩 sgjdjwns다.7) Incubator (37도, 5% CO2)에서 3시간 배양한다.② Cell lysis for mRNA preparation1) PBS wash → RNA isolation reagent(1ml) → store at -80℃ (조교님이 해주심)4. RNA isolation① Cell Pre) 원심분리를 통해 RNA를 침전시킨다.3) 원심분리 후 상등액을 제거하면 하얀색의 RNA 침전물이 확인된다.(침전물이 잘 확인 되지는 않았지만 있을것이라는 희망을 가지고 실험을 계속하였다)⑤ RNA 세척1) 상등액을 제거한다.2) 75% DEPC-treated ethanol을 1ml 넣고 vortexing 한 후, 원심분리한다.⑥ RNA 용해1) 상등액을 제거한 후, tube를 거꾸로 세워서 RNA pellet을 공기 중에서 5분간 말린다.2) 적정량의 RNase-free water(20㎕)를 pelle에 첨가한다.3) 55~60℃에서 10분 동안 방치하여 RNA를 용해시킨다.⑦ RNA 정량5. Reverse transcription① 각 RNA sample에 대하여 Autoclaved 0.2ml tube에 다음과 같이 mixture를 만든다.tube 1tube 2tube 3tube 4RNA2.2㎕3.1㎕2.7㎕3.7㎕물6.8㎕5.9㎕6.3㎕5.3㎕Oligo dT1㎕1㎕1㎕1㎕② 완성 된 mixture을 70℃에서 5분, 4℃에서 5분동안 incubation시킨다.③ EP-tube에 다음과 같이 mixture을 만든다.Nuclease free water4.8㎕ImProm-Ⅱ5×Reaction buffer17.6㎕MgCl210.6㎕dNTP4.4㎕RNase inhibitor2.2㎕ImProm-Ⅱ Reverse Transcriptase4.4㎕④ 1번의 RNA mixture에 3번의 mixture을 10㎕ 넣어준다.⑤ Thermal cycler machine을 이용하여 다음 step에 따라 진행한다.1) Incubate at 25℃ for 5 min.2) Incubate at 42℃ for 60 min.3) Incubate at 70℃ for 15 min.⑥ store at -20℃(5번 6번 과정은 조교님께서 해주셨습니다)6. PCR : TNF-α, IL-6, β-actin① 3종류의 mixture을 만든다.10×Reaction buffer8.8㎕dNTP(10mM150ml TAE buffer + 7.5㎕ DNA staining solution2) PCR 산물에 6×loading dye 4㎕를 섞어 gel 주형에 loading 한 후 전기영동을 한다.3) 100bp markger도 함께 loading한다.4) UV/gel doc system에서 DNA를 확인한다.Ⅳ. Result1. Cell Seeding에서 Hemocytometer cell counting59개의 cell이 counting 되었다.59 × 1/4 × dilution factor(4) × 104cells/ml2×106 : χ = 59×104 : 10mlχ = 3.38ml2. RNA 정량이 실험 결과를 통해서실험방법 5-③의 수치를 구할 수 있었다.tube 1의 RNA양을 예로 들어보면455.6ng : 1㎕ = 1000ng : χ㎕물의 양 = 10㎕-(RNA양 + Oligo dT 1㎕)tube 1tube 2tube 3tube 4RNA2.2㎕3.1㎕2.7㎕3.7㎕물6.8㎕5.9㎕6.3㎕5.3㎕Oligo dT1㎕1㎕1㎕1㎕3. 전기영동 결과- DNA ladder의 가장 아래쪽 band는 100bp를 나타내는데, TNF-α band는 181bp,IL-6 band는 432bp, β-actin band는 274bp의 크기를 갖는다는 정보를 가지고 확인한 결과 적절한 위치에서 band가 나타나는 것을 확인 할 수 있었다.- WT의 mouse에 LPS 자극을 주었을 때 IL-6유전자가 발현 되는 것을 볼 수 있다.- IKKi 유전자가 KO된 mouse에 LPS 자극을 주었을 때도 마찬가지로 IL-6 유전자가 발현 되는 것을 볼 수 있다.- TNF-α의 발현 양을 확인 하는 6,7 line에서의 sample leak로 인해 실험 결과를 확인 할 수 없었다.- 8 line에서 IKKi 유전자가 KO된 mouse에서 TNF-α 유전자가 발현 되는 것을 볼 수 있다.- β-actin의 발현을 확인하는 마지막 4개 band는 모두 동일한 양이 발현 되고 있다.Ⅴ. Discus예상했다.이 실험에서 사용한 자극원은 LPS로 TLR4와 결합하여 Innate Immune System을 활성화시켜 Cytokine인 IL-6와 TNF-α의 발현을 야기한다.IKKi는 IKK의 한 종류로서, IKK는 IκB를 인산화 시켜 NF-κB를 활성화 시키는 데에 필수적이다. 활성화된 NF-κB는 전사인자로 작용하여 apoptosis와 inflammation에 관련된 인자들의 유전자 전사를 촉진한다. 우리가 이번 실험을 통해 확인한 IL-6와 TNF-α 역시 NF-κB의 Target gene에 해당한다.하지만, 실험 결과를 보면 IKKi K/O cell과 WT cell의 IL-6의 발현 정도는 크게 차이가 없다. 이는 IKKi gene이 NF-κB pathway에 필수적인 요소는 아니라는 것으로 볼 수 있다. 그림에서 보듯이 IKKi가 포함되지 않은 NF-κB 활성화 경로를 통해서도 LPS 자극 시 IL-6와 TNF-α를 발현 시킬 수 있다.5,6,7,8번 line에서 TNF-α의 발현량을 확인 할 수 있었다. Leak으로 인해 밴드를 확인할 수는 없었지만 TNF-α도 IL-6와 같은 양상으로 LPS 자극이 있을 시에만, WT와 IKKi gene이 KO된 cell 에서 동일하게 발현됐을 것으로 추측했다. 예상대로 우리와 똑같은 실험을 한 4조의 결과를 보고 우리의 추측이 맞다는 것도 확인 하였다. Leak의 원인으로는 실험자의 미숙함을 들 수 있다. sample을 구멍에 주입할 때 tip이 gel에 구멍을 냈을 것이라고 예상한다.9,10,11,12번 line에서 β-actin의 발현량을 확인 할 수 있었다. β-actin은 House keeping gene으로서 LPS의 자극 유무와 상관없이 항상 일정량 발현된다. 4개의 sample에서 거의 동일한 양이 발현된 것으로 보아 실험의 결과가 유의미함을 알 수 있다.IKKi는 앞서 살펴 본것처럼 IRF3와 NF-kB를 활성화 시켜 염증성 사이토카인을 생산한다. 특히 NF-kB보다 IRF3에 더 많은 영향을 미니다.

의/약학| 2020.12.27| 7페이지| 3,000원| 조회(138)

macrophage, LPS, 예방약학, TNF, 생체방어기작

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제제학(약제학) 실험레포트 2 캡슐제의 제조 (A+ 받은 레포트)

약제학 실험실습 결과 보고서실험 제목: 캡슐제의 제조1. 이론 (Theory)1) 캡슐제의 정의와 구분의약품을 액상, 현탁상, 반고형상, 분말상, 과립상, 또는 성형물 등의 형태로 캡슐에 충전하거나 캡슐기제로 피포 성형하여 만든 제제이다. 의약품을 젤라틴 캡슐에 충전한 경질캡슐제와 탄력성이 있는 젤라틴막으로 피포 성형한 연질캡슐제로 구분된다.? 경질캡슐제그림 1 캡슐의 구성 경질캡슐제는 피막은 젤라틴을 주원료로 하고 가소제, 방부제, 색소, 불투명화제 등으로 구성되어있다. 색과 맛이 없으며 35~40°C 수용액에서 겔로 경화하므로 체온에서 금방 녹는 특징이 있다. 또한 13~16%의 수분을 함유하고 있다. 여기서 주원료인 젤라틴은 콜라겐의 부분 가수분해를 통해 얻으며 50~1000개의 아미노산으로 구성된 한 개 또는 여러 가닥의 polypeptide들의 혼성혼합물이다. 또한 젤라틴은 냉수에 녹을 수 없으며 중량의 10배까지 물을 흡수하여 연화가 된다. 온수나 위액 중에서 쉽게 용해되어 신속히 내용물을 방출되어 용해된 젤라틴은 단백질 분해효소에 의해 소화되기 때문에 따뜻한 물과 함께 복용하는 것이 좋다. 젤라틴을 쓸 수 없는 주약의 경우 폴리에틸렌글리콜(PEG), Hypromellose(HPMC)를 사용할 수 있다. 그리고 캡슐은 오른쪽 과 같이 긴 부분인 몸체(body)와 짧은 부분인 캡(cap)이 다른 색을 띤다.그림 2 캡슐의 크기 캡슐의 크기는 왼쪽의 와 같이 000호부터 5호까지 총 8가지로 나누어지는데 이는 충전될 물질의 양에 의해 결정되며 충전물의 밀도와 압축성 역시 캡슐에 충전할 수 있는 내용물의 양을 결정한다.또한 경질캡슐은 보관이 매우 중요한데 이는 경질캡슐은 수분과 습도에 민감하기 때문이다. 습도가 높은 환경에서는 수분을 흡수하여 외관에 변형이 발생하지만 지나치게 건조하면 수분이 방출되어 부서지게 된다. 따라서 상대습도 30~50%에서 보관해야 한다. 또한 제습제(건조 실리카겔, 점토, 활성탄 등)와 함께 포장하여야 한다.? 연질캡슐제연질캡슐 봉합 방법은 젤라틴 밴드로 봉합하는 방법, 열 용접 과정으로 봉합하는 방법, 액상습윤제를 이용하여 캡슐의 캡과 몸체의 접촉 부분의 녹는점을 낮춘 후 낮은 온도에서 열로 결합하는 방법 등이 있다.? 연질캡슐제 : 연질캡슐 제조 및 충전 가능 약물을 액상으로 제조하고, 충전한 후 건조와 세척을 실시한다.충전할 약물은 액상, 현탁상, 풀상, 페이스트, 분말, 펠렛, 정제로 충전하며 액상 약물 자체 또는 액상 첨가제와 혼합하여 충전한다. 고체 약물 충전시 액상 첨가제에 용해, 현탁하거나 풀상으로 제조하여 충전한다. 이 때, 충전 대상이 물과 섞이는 비휘발성 액상이면 주로 폴리에틸렌글리콜을 용제로 사용하며 물과 섞이지 않는 휘발성 및 비휘발성 액상일 경우 유상기제에 혼합하여 충전한다.연질캡슐제의 제조방법은 평판법, 로터리 다이법, 왕복식 다이법, 심리스 캡슐제 제조 적하법 등이 있다.4) 질량편차시험질량편차시험법은 제제 질량의 편차를 함량의 편차로 보고 개개 제제의 질량을 측정하여 제제 중 주성분 함량의 균일성을 추정하는 시험법이다.? 질량편차시험을 적용하는 제제(1) 모든 성분이 완전하게 녹아 균질하게 된 액을 개별용기에 넣은 제제 (연질캡슐을 포함한다).(2) 다른 주성분 및 첨가제를 함유하지 않고 한 성분으로만 된 제제 중 산제, 과립제 및 쓸 때 녹여 쓰는 주사제 등의 고형제제를 개별 용기에 넣은 제제(3) 모든 성분이 완전하게 녹은 액을 최종용기 내에서 동결건조하여 만든, 쓸 때 녹여 쓰는 주사제 등의 고형제제로 제법이 라벨 또는 첨부문서에 기재되어 있는 제제(4) 경질캡슐제, 나정 또는 필름코팅정으로 주성분 함량이 25 mg 이상이고 동시에 제제 중 주성분의 비율이 질량비로서 25 % 이상인 경우 해당 성분. 다만 주성분을 함유하지 않는 코팅층, 공캡슐 등을 제외하고 계산하며 주성분이 2개 이상일 때는 각각의 성분에 대하여 계산한다.(5) 주성분의 함량기준이 표시량에 대한 허용편차 10 %를 벗어나는 제제 중 해당 성분(6) 의약품 각조에 질량편차시험법을 mesh)48.038.4g스테아린산마그네슘 (60 mesh)1.00.8g탈크 (60 mesh)5.04g그리고, 캡슐충진기에 1호 공캡슐을 넣고 과립을 기계위에 혼합물을 충전한 후 충전기 장치를 이용해서 압축한다. 결과적으로 충전된 캡슐 (Vitamin C 100mg 캡슐)을 뺀 후 용기에 저장하여 제제균일성(질량편차시험)를 약전에 따라 시험하고 판정한다.3. 실험 결과 (Results)약전에 따라 10개의 캡슐을 무작위로 선정한 뒤 질량을 측정하고, 아래 의 용어 정리에 따라 이와 같이 정리해 보았다. (질량편차시험에서는bar{X}=A로 두고 판정한다.)캡슐캡슐 질량(g)주성분함량 추정값 (g)x_n (%)10.4220.13093079100.715990520.4160.1290692199.2840095530.4230.13124105100.954653940.4250.13186158101.431980950.4110.127517998.0906921260.4170.1293794799.5226730370.4230.13124105100.954653980.4160.1290692199.2840095590.4220.13093079100.7159905100.4150.1287589599.04534606평균0.4190.130000100표준편차0.004570.001418041.090796277판정값은|M-bar{X} |+ks인데, 질량편차시험에서는bar{X}=A로 두고 판정하고,k=2.4,s=1.09로 두고 계산하면 판정값은 2.616%이다. 이 값은L1%=15%를 넘지 않으므로, 제제가 균일하다고 할 수 있다.그림 3 약전의 용어 정리4. 고찰 (Discussion)이번 실험에서는 경질캡슐제 100개를 Feton 수동식 캡슐 충전기를 이용하여 제조하였다. Vitamin C 분말을 주성분으로 하고 미결정셀룰로오스 PH-102, 분무건조락토스, 스테아린산마그네슘, 탈크를 첨가제로 하여 실험을 진행하였다. 여기서 미결정셀룰로오스 PH-102, 분무건조락토스는 부형제이며 정확한 용량을 취전하고 있다고 가정하여 0.5g의 내용물을 가지고 있고 Vitamin C는 그중 약 26%이므로0.5 times 0.26=0.13(g)으로 표시량을 가정하였다. 또한 식x_{i}=w_{i} times {A} over {bar{W}}임을 이용하여 1번부터 10번까지의 주성분함량 추정값x_i(g)를 구할 수 있었다.A는 표시량에 대한 %이므로 주성분함량 추정값을 표시량으로 나눈 후 100을 곱하여 구할 수 있었다. 또한 약전에 따르면M은 98.5%와 101.5%를 기준으로 하여 값이 나누어지므로 그를 기준으로 하였고, 그에 따라서 판정값|M-A |+ks를 구할 수 있었다.결론적으로 판정값이 2.616%이며, 이 값은L1%, 즉 15%가 넘지 않았다. 따라서 추가적으로 20개를 가지고 같은 방법으로 시험하여 판정값을 계산할 필요도 없었다. 이렇게 약전에 의해 질량편차시험을 하니 우리가 만든 캡슐은 질량이 균일하여 제제가 충분히 균일하다고 결론내릴 수 있다. 이에 따라 첨가제와 활택제가 알맞은 비율로 잘 들어갔고, 제 역할을 잘 해냈다고 할 수 있다. 또한 Feton 수동식 캡슐 충전기를 사용할 때, 제제의 함량을 균일하게 하기 위해 약물과 첨가제를 한 번 충전했다가 가압을 하여 동일한 양이 들어갈 수 있게 맞추어 주는 과정도 적절하게 진행되었으며 마지막으로 캡슐을 봉합시킬 때 역시 균일한 함량을 맞추기 위해 같은 압력을 균일하게 가하여 주기 위해 노력한 것이 이번 실험 결과를 이끌어 낼 수 있었다.5. 결론 및 요약 (Summary)경질캡슐제를 Feton 수동식 캡슐 충전기를 이용하여 만들어 보았고, 이 때 여러 가지 사항을 고려하여 제제의 함량을 균일하게 하여야 한다. 또한 제제가 균일한지 시험하기 위해 약전에 의해 질량편차 시험법을 실시하였고 그 결과 우리가 만든 Vitamin C 캡슐은 균일한 질량을 가지고 있어 제제가 균일하다고 판정할 수 있다.6. 참고 문헌 (Reference):- 대한민국 약전 일반시험법- 약제학 총서1 제제학 Pharmaceutical는 방향제 등이 첨가된다.(3) 정제의 첨가제정제의 첨가제는 부형제, 결합제, 붕해제, 흡착제, 활택제, 유동화제, 부착방지제, 제어방출 첨가제, 보습제, 가소제 등이 있다.부형제는 희석제 또는 충전제라고도 불리며 주약이 소량일 경우 희석, 증량의 목적으로 첨가하여 정제를 적당한 크기로 제조하기 위해 사용한다. 이에 유당, 전분, 백당, 만니톨, 소르비톨, 인산칼슘, 규산알루미늄, 황산칼슘 등의 무기염, 직타용 희석제 등이 있다. 이번 실험에 사용한 부형제는 미결정셀룰로오스와 전호화 전분인데, 이는 직타용 희석제로써 우수한 유동성과 주약과의 배합성, 혼합성, 붕해성 등을 보유하여 granule 형태로 만들지 않아도 직접 타정이 가능하게 도와주는 물질이다.결합제는 처방된 분말입자간의 부착력을 증가시키고 결합력을 주어 성형을 용이하게 하고 정제의 물리적인 형태를 유지시킨다. 여기의 물, 에탄올, 아세톤 등의 용매 자체가 결합제 역할을 할 수 있으며 물리적으로 흡착한 수분은 정제의 압축성형에 필수 역할을 한다. 또한 백당, 포도당, 전분, 젤라틴, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 메틸셀룰로오스, 아라비아 고무 등은 수용성 습식 결합제이며 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈은 유기용매 용해성 습식 결합제로 수용매에 민감한 약물에 유용하다. 또한 건식과립이나 직접타정 시 결합제는 분무건조유당, 무수유당, 미결정셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 인산일수소칼슘 등이 있는데 이번 실험에서는 미결정셀룰로오스가 결합제와 부형제도 겸했음을 알 수 있다.붕해제는 정제에 첨가하여 붕해를 촉진하는 물질로 용출도 촉진할 수 있다. 수분에 노출되면 팽윤하거나 팽창하여 위장관에서 정제의 파손이나 파괴에 영향을 주며 습윤 속도가 클수록 붕해제의 역할은 커지고 일반적으로 친수성이 클수록 붕해제로서의 역할도 증가한다. 대표적인 붕해제로는 친수성 옥수수 및 감자전분, 전호화전분, 카르복시메틸셀룰로오스의 칼슘염, 메틸셀룰로오스, 결정셀룰로오스, 전분글리콜산나트륨, 크로스포비돈, 알긴

의/약학| 2020.12.13| 13페이지| 4,000원| 조회(1,431)

약제학, 캡슐제, 캡슐제의 제조, 정제의 제조

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제제학(약제학) 실험레포트 정제의 시험 (A+ 받은 레포트) 평가B괜찮아요

약제학 실험실습 결과 보고서실험 제목: 정제의 시험1. 이론 (Theory)정제는 외관 이외에 질량, 제제균일성(질량편차, 함량균일성), 두께, 경도, 붕해 및 용출 등의 다른 물리적인 규격과 품질기준에 적합해야 한다. 제조 과정 중에 관리되어야 하며 각 배치를 생산한 후에는 확립된 제품품질기준에 적합한지를 입증해야 한다.(1) 제제균일성 시험개개 제제 간의 주성분 함량의 균일한 정도를 나타내기 위한 시험이다. 따로 규정이 없는 한 단일제 또는 복합제에 함유된 개개의 주성분에 대하여 적용한다. 제제균일성은 아래 표에 따라 질량편차시험 또는 함량균일성시험 중 어느 한 방법으로 시험한다.? 질량편차시험질량편차시험은 제제무게의 편차를 함량의 편차로 보고 개개 제제의 무게를 측정하여 제제 중 주성분 함량의 균일성을 추정하는 시험방법이다. 나정 또는 필름코팅정으로 주성분 함량이 25mg 이상이고, 동시에 제제 중 주성분의 비율이 질량비로서 25%이상인 경우에 질량편차시험을 적용하며 이 조건을 만족하지 않는 경우는 함량균일성 시험을 한다. 다만 주성분을 함유하지 않는 코팅층, 공캡슐 등을 제외하고 계산하며 주성분이 2개 이상일 때에는 각각의 성분에 대하여 계산한다.나정 또는 필름코팅정일 경우 검체 10개를 가지고 개개의 질량을 정밀하게 달아 정량법에 따라 구한 평균함량으로부터 계산으로 개개 검체의 함량추정값을 구하여 표시량에 대한 %로 나타내고 판정값을 계산한다. 판정값이 15%를 넘지 않을 때 적합하며 만약 15%를 넘을 때에는 다시 검체 20개를 가지고 같은 방법으로 시험하여 판정값을 계산한다.? 함량균일성시험함량균일성시험은 제제 개개의 주성분의 함량을 측정하여 각각의 성분의 함량이 허용 범위내에 있는지를 확인하는 시험이며, 대한약전 제제균일성시험 중 질량편차시험 조건을 만족하지 않는 제제는 함량균일성시험을 하도록 되어있다. 함량균일성시험은 검체 10개에 대하여 개개 제제 중의 주성분 함량을 적절한 방법으로 측정하여 판정값을 계산하고, 그 값이 15%를 넘지 않을 때 한다. 비커에 넣는 시험액의 양은 시험기가 가장 위로 올라 왔을 때 시험기의 망면이 액면 아래로 적어도 15 mm 이상 떨어지도록 하고 시험기가 가장 아래로 내려갔을 때 망면은 비커의 바닥으로부터 25 mm 이상 이며 시험기가 완전히 잠기지 않도록 한다.d. 보조판: 플라스틱 디스크로 시험기의 상하운동시에 시료가 떠오르는 것을 억제하여 약간 눌러주는 효과가 있으며, 피막 등의 연질부유물을 시험기의 유리관 위로 밀어내므로 붕해여부를 판정하기 쉽게 된다.e. 보조통: 과립제나 과립제 함유 캅셀제를 시험하는 경우 사용하며, 보조통의 위아래는 금속제의 망으로 되어있어 과립이 빠져 내리지 않게 된다. (이번 실험에서는 정제를 쓰기 때문에 보조통은 쓰지 않았다.)② 시험액a. 제 1액 : 염화나트륨 2.0 g에 염산 7.0 mL 및 물을 넣어 녹여 1000 mL로 한다. 이 액은 무색투명하고 그 pH는 약 1.2이다.b. 제 2액 : 0.2 mol/L 인산이수소칼륨시액 250 mL 0.2 mol/L 수산화나트륨시액 118mL 및 물을 넣어 1000 mL로 한다. 이 액은 무색투명하고 그 pH는 약 6.8이다.c. 물③ 조작법a. 일반방출제제: 정제, 캡슐제, 환제 (생약을 함유하는 환제는 제외)에 대하여는 시험기 6개의 유리관 각각의 검체 1개씩을 넣고 물을 써서 37±2 ℃에서 시험기를 작동시킨다. 따로 규정이 없는 한 정제는 30분후, 코팅정제 및환제는 60 분 후, 캡슐제는 20 분 후에 시험기를 시험액에서 꺼내어 검체의 붕해 양상을 관찰한다. 검체의 잔류물 이 유리관 안에 없든가 있더라도 분명하게 원형을 나타내지 않는 연질의 물질일 때, 또는 불용성의 제피 또는 캡슐 피막의 단편일 때 검체는 붕해된 것이다. 모든 검체가 붕해되었을 때 적합하다. 1 개 또는 2 개가 붕해되지 않았을 때는 다시 12 개의 검체를 가지고 시험을 하고 총 18 개의 검체 중 16 개 이상의 검체가 붕해되었을 때 적합한 것으로 한다.(3) 용출시험법용출시험법은 경구제제에 대하여 용출시험넣어 녹여 1000 mL로 한다. 이액은 무색 투명하고 그 pH는 약 1.2이다.b. 제 2 액: pH 6.8 인산염 완충액ㆍ물 혼합액(1:1)c. 별도로 규정된 시험액: 대한약전 의약품 각조에 별도로 규정된 시험액을 사용한다.만약 시험액이 완충액일 때 pH를 규정값의 ± 0.05이내가 되도록 조정한다.? 조작법일반방출제제는 규정된 용기에 규정된 용량 ( ±1%)의 시험액을 넣고 장치에 연결한다. 시험액을 37 ± 0.5°C로 유지하고 온도계를 제거하고 검체의 표면에 기포가 생기지 않도록 주의하면서 용기에 검체를 넣고 바로 규정된 회전속도로 장치를 작동한다. 규정된 간격 또는 규정된 시간에 시험액의 표면과 회전검체통 또는 패들의 교반날개 윗면과의 중간이면서 용기 벽에서 10mm이상 떨어진 곳에서 시험액을 채취한다. 지시된 분석법을 써서 용출된 주성분의 양을 측정한다. 다른 검체에 대해서도 같은 방법으로 조작한다. 시험액은 규정된 시험액을 쓰고, 시험시간은 1시점에서 측정하도록 규정되어 있을 때는 규정된 용출률에 도달했을 때 그 시간이내에 시험을 마칠 수 있다.? 판정일반방출제제는 의약품각조에 Q값이 규정되어 있을 때는 판정법 1에 따르고 기타의 경우에는 판정법 2에 따른다.가) 판정법 1따로 규정이 없는 한 검체로부터의 주성분의 용출률이 판정기준표 1을 만족할 때 적합하다. S1 또는 S2를 만족하지 않을 때에는 S3까지 시험한다. Q는 규정된 주성분의 용출률이며 표시량에 대한 백분율로 표시한다. 표 중의 5%, 15%, 25%는 Q와 같이 주성분의 표시량에 대한 백분율로 표시한 것이다.그림 1 판정법1나) 판정법 2따로 규정이 없는 한 검체 6개에 대하여 시험하고 개개의 검체로부터의 용출률이 모두 의약품각조에 규정한 값일 때 적합하다. 규정한 값을 벗어나는 검체가 1개 또는 2개일 때 새로운 검체 6개에 대하여 시험을 반복한다. 12개 중 10개 이상의 검체 개개의 용출률이 규정한 값일 때 적합하다.2. 실험 방법 (Experimental)(1) 제제균일성 제조한다. 0.2 M KH 2PO4 용액 500mL에 0.2 M NaOH 용액 36 mL 및 물을 넣어 2000 mL로 한다.② 900 mL의 시험액을 용기에 넣고 37±0.5 ℃ 항온으로 한다.③ 패들을 shaft에 고정시킨다.④ 패들 밑바닥이 용기바닥에서 2 cm 떨어진 상태가 되도록 shaft를 회전축에 고정시키고 100 rpm으로 회전시킨다.⑤ 각 Vessel에 시험 정 1개를 넣고 초시계를 누른 후 샘플링을 시작한다.⑥ 용출시험개시 30분 후에 용출액을 취하여 여과하고 필요한 경우 여액에 시험액을 넣어 희석하여 검액으로 한다.⑦ 아세트아미노펜 표준품 적당량을 정밀하게 달아 시험액에 녹여 검액과 같은 농도의 용액을 만들어 표준액으로 한다 (검량선으로 대체).⑧ 검액 및 표준액을 가지고 243 nm에서 UV 흡광도를 측정한다.⑨ 판정: 30 분간의 용출률이 80 % 이상일 때 적합하다.주의 사항1) 샘플링 위치 : 시험액의 표면과 패들의 교반날개 윗면과의 중간이면서 용기 벽에서 10mm 이상 떨어진 곳에서 시험액을 샘플링한다.2) 여과하는 이유 : 용출 전 상태의 붕해 잔류물이 취해지는 것을 방지한다.3) 시험액에 녹아 있는 기체는 기포의 원인이 되고 시험결과에 영향을 줄 수 있다. 녹아있는 기체가 용출시험 결과에 영향을 줄 때는 시험하기 전에 탈기한다.3. 실험 결과 (Results)(1) 제제균일성시험(질량편차시험법)표 1 질량편차시험 결과정제정제 질량(mg)주성분함량 추정값 (mg)x_n (%)1264.199.405299699.405299612269.4101.400181101.40018073269.9101.588377101.5883774259.597.673893497.673893415267.3100.609756100.60975616261.698.46431898.46431798725696.356519196.356519128265.499.894610199.894610069272.4102.529359102.529358610271.2102.077687102 때 시험액의 blank 흡광도값인 ?0.004를 빼 주어 보정한 후 계산하였다. 또한, 용출량(mg)를 구할 때에는 희석계수를 고려하여야 하므로(농도 times희석계수times900mL)를 이용하여 계산하였다. 이 때 900mL는 시험액의 부피이다.→각 검체 모두가 30분동안의 용출률이 80%가 넘으므로 적합하다.4. 고찰 (Discussion)이번 실험에서는 저번 실험 때 제조하였던 Ultrophen 100mg 정제를 이용하여 질량편차시험, 붕해 시험을 약전에 따라 진행하였고, 시판되는 아세트아미노펜 500mg 정제를 이용하여 용출시험을 약전에 따라 진행하였다.질량편차시험은 저번주에 제조하였던 정제가 함량/주성분 농도가 25mg이상 및 25%이상이라 가정하였으므로 질량편차시험으로 함량균일성시험을 대신할 수 있었다. 정제 10개의 무게를 이용하여 질량편차시험을 하였다.붕해 시험은 내복용의 고형제제가 소화관액 등의 액 중에서 붕해되어 적어도 그 구성입자까지 분산하는 현상을 말하는데, 반드시 활성 성분의 완전한 용해를 의미하는 것은 아니다. 붕해 시험 시에 비커에 넣는 시험액의 양이 중요한데, 이는 시험기가 가장 위로 올라 왔을 때 시험기의 망면이 액면 아래로 적어도 15mm 이상 잠기도록 해야 한다. 보조판은 시험기의 상하운동시, 시료가 떠오르는 것을 억제하여 모든 검체가 균일한 조건에서 시험되는 것을 도와주며 플라스틱 디스크로 되어있다. 또한 피막 등의 연질부유물을 시험기의 유리관 위로 밀어내는 효과도 있으므로 붕해 여부를 판정하기 쉽게 도와준다. 또한 과립제나 과립제 함유 캅셀제를 시험할 때에는 보조통이 필요한데 이번 실험에는 정제만 실험했으므로 사용하지 않았다. 시험액은 사람의 위장관과 최대한 비슷한 환경을 조성하기 위해 pH가 조절되어 있는 buffer 용액을 사용해야 하지만 이번 실험에서는 여러 가지 조건 관계상 증류수를 이용하여 실험하였다. 조작은 약전에 따라 진행하였는데, 우리가 만든 정제는 장용정이 아니고 일반방출제제이며 따로 코팅되있거나 환제도

의/약학| 2020.12.13| 10페이지| 4,000원| 조회(1,908)

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형질전환(Transformation), 유전자 정제, 전기영동(gel electrophoresis) 실험 레포트

실험 레포트 2주차형질전환 (Transformation), 유전자 정제 및전기영동 (gel electrophoresis)201422028약학과 OOOⅠ. Abstract실험 목적은 외부 DNA의 bacteria plasmid로의 transformation, transformation이 된 bacteria에서의 plasmid isolation, 그리고 electrophoresis를 통한 plasmid의 확인이다.실험목적에 부가적으로 plasmid의 conformation, bacteria간 plasmid self replication의 정도차이 등을 볼 수 있었다. Plasmid isolation ? electrophoresis에서는 네종류의 외부DNA-transformation-bacteria를 사용했으며, electrophoresis결과, plasmid가 올바른 band형태로 검출되어 isolation에 성공하였다.Ⅱ. IntroductionDNA 전기영동법의 원리는 protein electrophoresis에서와 비슷하여, voltage를 걸어주어 DNA길이에 따라 shifting되는 현상이다. DNA의 phosphorus side chain이 ? charge를 가짐을 이용하게 된다. 이때 분자량이 클수록 gel matrix를 통과하는 속도가 느려진다. 또한 분자량이 같더라도 구조가 다르면 이동속도가 달라진다. 예를 들면 supercoil된 DNA는 선형 DNA보다 빠르게 움직이게 된다.EtBr(ethidium bromide)은 DNA 사이사이에 끼어 들어가 DNA를 X선으로 감광시켰을 때 검출되도록 하는 시약이다.형질 전환이란 외부 DNA를 숙주세포 내에 넣어주어 세포가 원래의 성질과는 다른 새로운 유전형질을 추가로 얻게 되는 것을 말한다. E.coli의 형질전환은 초기에는 발견이 되지 않았으나 박테리아를 찬 CaCl2로 처리한 다음 잠시 열처리를 하면 박테리오파지가 세포로 들어가 파지를 형성한다는 사실에 의해 처음 관찰되었다. 이와 같은 처리는 박테리아가 DNA를 흡수할 수 있는 수용능상태로 일시적으로 유도하는 것으로 박테리오파지뿐 아니라 plasmid DNA 등 여러 종류의 DNA에 의해 형질전환이 될 수 있다.plasmid isolation과정에서 ion exchange chromatography를 사용하는 원리는 사용할 Qiaprep spin column의 base는 (+)charge, SDS-plasmid는 (?)charge를 띠고 있어 이 column이 plasmid isolation에 사용되고, 이후에 (?)charge ion을 포함하는 buffer를 apply하면 buffer용액이 column basement에 대신 붙고 plasmid는 soup으로 떨어져 나오게 된다.Ⅲ. Materials & Methods1. Materials1) Transformation- 10cm agar plate 각 5장/group- competent cell (DH5a)2) Plasmid isolation and agarose gel electrophoresis- bacterial culture- agarose gel- agarose gel electrophoresis apparatus- Qiaspin plasmid mini-preparation kit2. Methods1) Transformation- 다음과 같이 혼합한다.tube 1tube 2DNA (amp저항성을 갖는다)1㎕(DNA)1㎕(물)competent cell(대장균 cell)25㎕25㎕- ice 위에서 15분간 방치한다. (damage를 입기 때문에)- 42℃에서 60초간 heat shock을 준다.- ice에 5분간 방치한다.- tube에 prewarming된 LB medium 75㎕를 첨가한다.- 잘 혼합한다.- 각 plate에 번호를 1,2,3,4 또는 5로 기입한다.- 각 실험자가 한 개씩 나누어 갖는다.- 1, 2, 3번 plate는 tube 1번에서 33 ul를 취하여 plate에 loading하고, flame으로 멸균한 glass 봉을 이용하여 spreading한다.- 4, 5번 plate는 tube 2번에서 50 ul를 취하여 plate에 loading하고, flame으로 멸균한 glass 봉을 이용하여 spreading한다.- 물기가 다 흡수 될 때까지 문지른다. 문지르는 동안 agar gel이 찢어지지 않도록 조심한다.2) Plasmid isolation and agarose gel electrophoresis- 밤샘 진탕 배양한 bacterial culture supernatant 1ml를 microcentrifuge tube에 옮긴다.- 10,000 rpm에서 3분간 원심한다.- supernatant를 버리고 pellet을 plasmid isolation에 사용한다.- 250㎕의 P1을 넣고 완벽하게 suspension한다.- 250㎕의 P2를 넣고 gently inverting 한다. 4분간 실온에서 방치한다.- 350㎕의 N3 buffer를 넣고 inverting을 10회 반복하여 혼합한다.- 13,000rpm에서 10분간 원심분리한다.- supernatant를 Qiaprep spin column에 pipette을 이용하여 apply한다.- 30초간 원심분리한다.- 밑에 있는 supernatant를 버린다.- 750㎕의 PE buffer를 넣고 30초간 원심분리한다.- 밑에 있는 supernatant를 버린다.- 다시 1분간 원심분리하여 남아있을지 모르는 PE buffer를 완벽하게 제거한다.- Qiaprep column을 새로운 1.5 ㎖ microcentrifuge tube에 옮기고 50㎕의 EB buffer를 Qiaprep disk에 정확히 떨어뜨리고, 10,000rpm으로 1분간 원심분리한다.- Qiaprep column을 제거하고 50㎕의 eluent 중 1㎕를 0.7-0.8% agarose에 전기영동한다.- band를 확인하고 사진을 찍는다.Ⅳ. Results1) Transformation401개461개521개2) Plasmid isolation and agarose gel electrophoresis그림 5 [각 밴드의 순서는 마커-실패한 것-stat1-stat2-stat3-stat4 이다]- Marker의 경우 Lamda DNA/HindIII Marker를 사용했는데, 이를 바탕으로 각 bacteria에서의 plasmid의 길이(몇 kb인지)를 판단하며, 선의 두께를 통해 DNA의 총량도 비교할 수 있다.- Marker를 이용하여 plasmid shifting length와 DNA length사이의 상관관계를 얻었다. 이를 이용하여 나머지 5개 실험결과에서 나타난 plasmid가 대략 몇 kb인지를 추측할 수 있다.pACT35.1442.9730.134.376Stat137.6826.430.144Stat229.8438.3126.830.648Stat331.3339.3727.631.496Stat431.7339.3727.631.496전개거리 normalsupercoil70% 추정80%추정pACT5.973.019.306.38Stat14.7812.869.25Stat29.494.5312.378.85Stat38.334.1211.598.21Stat48.054.1211.598.21단위 kbpstat23.52stat32.36stat42.08- supercoil이 전기영동시 이동이 빠르기 때문에 실제 길이와 분자량을 구하기 위해 0.7이나 0.8을 곱해야 하는데, 이 실험에서는 0.8 곱한 값이 더 정확하다.Ⅴ. DiscussionDNA를 전기영동 할 경우 DNA의 (?)charge로 인하여 SDS treated protein처럼 세로방향으로 길게 전개가 되어, DNA의 길이(base 숫자)에 따라 분리가 된다. marker는 fragment(linear)지만 loading시키는 것은 linear형태가 아닌 plasmid(circular)라는 것을 염두에 두어야한다.plasmid는 supercoil conformation형태가 가장 짧고 안정한 form이기 때문에, 이 form이 가장 진하고(양이 많고) 멀리서 나타나있으며, supercoil에서 약간 풀렸거나 아예 그냥 circular form의 plasmid 들이 다른 band에 연하게(양이 적고) 나타났다. 실제로 plasmid는 nicked-open circular, relaxed circular, linear 등, supercoil외에 여러 개의 conformation을 갖는다.실험 결과 나온 밴드중에 아래부분에 위치한 밴드가 supercoil임을 예상할 수 있었고, 그 위쪽의 밴드가 linear임을 알 수 있었다. 마커와 비교한 supercoil의 거리에 0.7을 곱해준 값이 linear의 거리와 비슷하다는 점을 이용하여 좀 더 정확한 DNA의 분자량을 알아낼 수 있다. 우리 조의 실험 결과 supercoil에 0.8정도를 곱해야 실제 linear과 비슷하다는 것을 발견 할 수 있었다.형질전환 실험에서는 대조군으로 4번과 5번 plate에 물을 넣어주었고, 1번, 2번, 3번 plate에는 DNA를 넣어주었다. 401, 461, 521개의 콜로니가 각각 자란 것으로 보아 비교적 정확하게 실험을 하였다. 같은 양을 도말하였기 때문이다. 하지만 1번 plate의 콜로니 수가 비교적 작은 이유를 생각해 보자면 박테리아가 튜브 속에서 완전히 vortexing 되지 않아서 균일하지 못한 농도의 박테리아가 첨가 되었을 가능성이 있다. 다른 원인을 찾아본다면 DNA의 경우 열에 의해 손상되기 쉽기 때문에 1번의 경우 열에 의한 손상된 DNA가 유입 되었다고 생각하여 콜로니가 발생 되지 않았다고 추측할 수 있다.

자연과학| 2020.12.13| 7페이지| 2,500원| 조회(170)

형질전환, 전기영동, Transformation, gel electrophor..

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UV를 이용한 단백질의 절대량 분석 및 SDS-PAGE를 이용한 단백질의 전기영동 레포트 평가A좋아요

실험 레포트 1주차UV를 이용한 단백질의 절대량 분석 및 SDS-PAGE를 이용한 단백질의 전기영동201422028약학과 OOOⅠ. TitleUV를 이용한 단백질의 절대량 분석 및 SDS-PAGE를 이용한 단백질의 전기영동Ⅱ. Abstract본 실험은 BSA standard solution을 가지고 미지 concentration의 sample 1,2,3의 concentration을 DC protein assay를 통해 알아내고, sample 1,2,3을 marker와 함께 SDS-PAGE를 통해서 loading하여 sample의 양을 다시 한 번 확인 한다. 본래는 gel도 직접 만들어야 했으나, 시간관계상 미리 만들어 놓은 gel을 사용했고, experiment에서는 DC protein assay와 electrophoresis만 진행되었다.Ⅲ. Introduction1. 단백질의 정량법1) UV법단백질에 있는 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판 잔기들은 각각 275nm와 280nm의 자외선을 흡수한다. 많은 단백질들에 있어 이 아미노산들을 합친 수준은 거의 일정하므로 단백질의 농도는 280nm에서의 흡광도와 비례하게 된다. 단백질의 흡광도는 주로 아로마틱 잔기에 기인하는 점에 주목해야 하며 참고로 펩타이드 결합의 경우는 ~200nm에서 빛을 흡수한다. 흡광계수(빛이 시료 1cm를 통과할 때의 흡광도)는 단백질 시료에 따라 다르다. 대부분의 단백질의 값이 1mg/ml 시료에 대하여 0.4~1.5 정도이며 아로마틱 잔기의 조성이 높은 라이소자임은 2.65, 티로신과 트립토판이 거의 없는 pravalbumin은 0.0의 값을 갖는다. 원하는 단백질의 흡광계수 값을 알면 시료의 농도를 측정할 수 있다. 이에는 람버트-비어의 법칙이 적용된다.A=εbc (A:흡광도, b:빛이 지나가는 시료층의 두께 c:빛이 지나가는 시료의 농도 ε:흡광계수)2) Bicinchoninc Acid(BCA법)BCA법은 Lowry method을 개량한 것으로 Folin시약의 반응 대신 BCA가 ophotometer를 이용, 흡광도를 측정하여 standard물질인 BSA(Bovine Serum Albumin)나 BGG(Bovine Gamma Globulin)를 기준으로 자신의 시료에 단백질이 얼마만큼 들어있는지 측정하는 방법 중 하나이다. 신속하고 간편하게 단백질을 정량할 수 있어 널리 쓰인다. Dye로는 Coomassie Blue G-250를 사용하며, 이 dye가 단백질과 결합해 생기는 파장의 변화를 측정한다.Acidic environment reagent조건 하에서 단백질은 Coomassie dye에 결합하는데 이 결과로 reddish/brown form(465nm에서 최대 흡광)이던 dye는 blue form(610nm에서 최대 흡광)으로 스펙트럼 이동이 일어나게 된다. 두 가지 form의 차이는 595nm에서 최대가 되는데, 따라서 이 파장이 Coomassie dye-protein complex의 blue form을 측정하는데 최적의 파장이 된다. 575nm~615nm사이의 어느 파장에서든 blue form을 측정할 수는 있지만 595nm에서 측정한 것보다 측정되는 흡광도 값이 10%정도 낮아지게 된다.Bradford protein assay에서 Coomassie dye ligand는 단백질의 positive charged된 부분에 결합하기 때문에 basic amino acid인 arginine, lysine, histidine잔기가 필요하다. (주로 dye와 작용하는 amino acid는 arginine이다) 또한 Dye-protein complex를 형성하기 위해 van der Waals, hydrophobic interaction도 작용하며, 단백질의 크기 또한 영향을 미친다. 일반적으로 3000Da 미만의 단백질은 Bradford assay로 정량할 수 없다. Bradford assay는 실온에서 사용가능하며, 어느 특별한 장비를 필요로 하지 않는다. (Spectrophotometer, cuvette, dye정도가 필요하다) 어느 단백. 발색은 구리(II)이온과 착체가 형성되어 이루어진다. 트리펩티드 이상의 펩티드도 같은 반응을 보이고, 발색률은 펩티드에 따른 차이가 거의 없다. 뷰렛(NH2CONHCONH2)에서도 같은 반응을 나타내기 때문에 이러한이름을 사용한다. 단백질 정량에도 사용하지만 감도가 낮다.이 결점을 개량한 것으로 페놀시약에 의한 반응과 조합한 방법을 사용하고 있다.6) Kjeldahl법단백질, 질소를 포함하는 타 유기물의 총 질소량 정량에 널리 이용된다. Protein을 촉매가 포함되면 진한 황산과 함께 오래 끓이면 질소는 로 전환된다. 이 혼합물에 일정한 과량의 NaOH를 넣고 증류하면 Ammonia가 발생한다. 이 Ammonia를 용액에 흡수시킨 후 표준 산 용액으로 정적하여 Ammonia의 양, 즉, 질소의 양을 측정할 수 있다. Protein은 평균 16%가량의 질소를 포함한다. 1mg의 질소는 6.25mg의 단백질이라고 볼 수 있다. 따라서 Kjeldahl법으로 측정한 질소의 값에 6.25를 곱해주면 protein 함량을 알 수 있다. Kjeldahl에 의하여 개발되엇다. 매크로켈달법, 세미마이크로켈달법, 마이크로켈달법이 있고, 시료 중 질소량의 다소에 따라 방법을 선택한다.2. 단백질의 전기영동의 기본 원리(단백질이 - charge에서 + charge로 움직이는 이유 및 separating gel과 stacking gel에서 각각 pH 8.8과 pH 6.8을 사용하는 이유)순도와 분자량을 추정하는 데 일반적으로 이용되는 전기영동법은 계면활성제인 도데실 황산 소듐(sodium dedecyl sulfate, SDS)을 사용한다. 단백질은 분자량의 1.4배의 SDS와 결합하여 아미노산 잔기 당 거의 1분자의 SDS가 붙게된다. 결합된 SDS는 전체적으로 다량의 알짜 음전하를 띠게 되어 단백질 고유의 전하는 의미가 없게 되고 각 단백질마다 매우 유사한 질량 당 전하 비를 가지게 된다. 이때 SDS가 음전하를 띄고 있기 때문에 단백질은 -charge에서 +charge로 움이 원활이 진행되지 않기 때문에 beta-mercaptoethanol을 사용하게 된다.Bromophnol blue는 tracking dye 즉 전기영동이 얼마나 이루어졌나를 gel상에서 확인하기 위해 첨가하는 dye이다.Coomassie Brilliant Blue를 이용하는데, 이 molecule은 6개의 phenyl group들과 2개의 sulfonic acid group들을 통해서 단백질과 결합한다. hydrophobic interaction을 통해 aromatic amino acid와 binding하며 (Try, Tyr, His, Phe)과 electrostatic force을 통해 basic(NH3+group) amino acid (Arg and Lys)와 결합을 한다. 따라서 non-specific 하게 protein과 결합을 해 Eloectrophoresis된 gel을 staining후 destaining과정에서 protein을 제외한 나머지 부분은 destaining되고 protein은 blue로 남게 되는 것이다.Ⅳ.Materials&Methodes1. Reagent : tris-HCl/SDS, Gly buffer(pH6.8 and pH8.8), 10% APS, TEMED, Commassie blue staining solution, destaining solution, 6X loading dye(본 experiment 에서는 SDS와 DTT등을 포함하고 있었음), prestained protein molecular weight marker, BAS standard solution(0 mg/ml, 0.125 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.5 mg/ml 1.0 mg/ml), 미지 concentration의 sample protein A, B, C2. Apparatus : pipette man set, pipette aid, gell cassette, gel preparing stand, electrophoresis apparatus, spaolution A+S를 25 ul씩 넣는다. (A:S = 1000:20 으로 mix하여 사용)(3) DC protein assay kit에서 solution B를 200 ul씩 넣는다.(4) 15분간 방치한다.(5) 750 nm에서 흡광도를 측정한다 (750 nm가 없는 경우 690 nm에서 측정해도 무방하다).(6) 각각 흡광도를 기록한다.3) Protein 농도의 계산Excel file를 이용하면 편리하다.4) stacking gel preparation(1) resolving gel의 1-butanol을 버리고 증류수로 washing한다.시약명최종농도양4X tris-HCl/SDS (pH 6.8)1X1.5 ml30% acrylamide5%1 mlWater3.5 ml최종 volume6 ml(2) 다음과 같이 mix한다.(3) (2)의 soultion에 다음과 같이 mix하고 빨리 resolving gel 위에 붓는다.시약명최종농도양10% APS60 ulTEMED6 ul(4) combe을 삽입한다.(5) stacking gel이 굳을 때 까지 기다린다.5) sample의 준비(1) 다음과 같이 sample을 준비한다.tybe #단백질양6X dyeWater1Stand solution (0.25 mg/ml)2 ul3132sample 12 ul3133sample 22 ul3134sample 32 ul313(2) 잘 mix한다.(3) heat block에서 95도씨에서 5분간 boiling한다.(4) stacking gel이 굳은 것을 확인한 후 전기영동 장치를 조립한다.(5) combe을 전기영동 장치에서 제거한다.(6) 전기영동장치에 1X tris-glycine buffer를 채운다.(7) 단백질을 loading한다.lane 1: prestained protein markerLane 2: standard solutionLane 3. sample 1Lane 4. sample 2Lane 5. sample 3(8) 전기영동을 실시한다. (gel 한 장당 22.5 mA)

자연과학| 2020.12.13| 12페이지| 2,500원| 조회(286)

단백질, 전기영동, SDS, UV, SDS-PAGE, 실험레포트, 단백질의 절대량

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