화공환경과 생물화학공학실험 실험보고서학번반조이름실험일제출일2019.03.122D8정재혁2019.11.132019.11.202019.11.272019.12.041. 실험제목 : 중합 효소 연쇄반응(PCR)과 전기영동 실험2. 실험목적 : 중합 효소 연쇄반응(PCR)을 통해 대장균 DNA의 PCR Product를 얻어낼 수 있다.전기영동 실험을 통해 얻어낸 PCR Product의 base pair를 확인할 수 있다.-----------------------------------------------------------------------------------------------------------3. 관련이론3.1. DNA와 RNA3.1.1 DNADNA(DeoxyriboNucleic Acid)는 인산기, 당 분자, 질소 염기로 이루어진 뉴클레오타이드의 중합체로 두 개의 긴 가닥이 서로 꼬여있는 이중 나선 구조의 고분자화합물이다. 또한, 사이토신(C), 구아닌(G), 아데닌(A), 티민(T)의 네 종류의 뉴클레오타이드가 중합과정을 통해 연결된 가닥이다. DNA의 기능은 총 4가지로,① 정보를 저장② 단백질 합성을 지시③ 화학적 유전적 특징의 변화 (돌연변이)④ 복제가 있으며, 이와 같은 기능은 이중 나선 구조라는 DNA의 독특한 구조 때문에 가능하다.3.2.2 RNARNA(RiboNucleic Acid)는 오탄당의 일종인 리보오스를 기반으로 뉴클레오타이드를 이루는 핵산의 한 종류이다. 하나의 나선이 길게 꼬여있는 구조를 지니며 DNA 일부가 전사되어 만들어진다. RNA는 단백질을 합성하는 과정에 작용하며 일부 바이러스는 DNA 대신 RNA를 유전물질로 가지기도 한다. DNA에는 T(티민)라는 핵 염기를 가지고 있으나 RNA에는 T대신 U(유라실)를 가진다.분자 구조와 생물학적 기능에 따라 rRNA, mRNA, tRNA 등 9가지로 나뉜다.3.2. 중합 효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)3.2.1. 개요1983년 미국의 생화인 DNA 용액에서 연구자가 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. 또한, 증폭에 필요한 시간이 2시간 정도로 짧으며, 실험 과정이 단순하고, 전자동 기계로 증폭할 수 있으므로 PCR과 여기서 파생한 여러 가지 기술은 분자생물학, 의료, 범죄 수사, 생물의 분류 등 DNA를 취급하는 작업 전반에서 지극히 중요한 역할을 담당하고 있다.3.2.2. 원리시험관에서 (In Vitro) 미량의 DNA 특정 염기서열을 짧은 시간에 대량으로 복제하는 원리.변성(Denaturation), 상보결합(Annealing), 신장(Extension, Elongation)의 과정을 거쳐 진행된다.반복하는 횟수가 많아질수록 생성되는 표적 DNA의 수가 증가한다. 이때, 표적 DNA는(1+E)^{n}개로 증가하며, 여기서 E는,① 시료 DNA의 병성.② 프라이머와 외가닥 DNA와의 상보 사슬 결합③ 중합 효소 신장반응까지의 증폭 반응의 효율로 0 전기영동 실험의 원리-----------------------------------------------------------------------------------------------------------4. 실험준비 및 실험방법 :4.1. 중합 연쇄 효소 반응(PCR)실험준비 : 대장균 열 추출 상등액, PCR Premix Kit (i-Taq), 20mum, PCR 장비, Primer(F, R)실험방법① 2개의 다른 Primer (F, R)를 각각 1muL씩 넣는다② 대장균 열 추출 상등액을 넣어서 20muL에 맞춘다.③ 용액을 잘 섞은 다음 PCR 기계에 장착한 후 30 Cycle 동안 중합한다.4.2. 전기영동 실험실험준비 : PCR Product, DNA Marker, Loading Star, Agarose gel, 1X TAE 버퍼, 전기영동 장치, 영상시스템 장비, 카메라, Comb실험방법① Agarose 0.5g을 1X TAE 50mL에 녹인다. 이때, 전자레인지를 이용하여 녹여낸다.② 전기영동 장치에 녹 조심히 Loading 한다. 이때, 피펫을 수직으로 세워 Well을 찢거나 Loading 한 시료를 다시 새어 나오지 않게 주의한다.⑤ 전기를 연결하여 25~30분 정도 Gel을 Run 시킨다.⑥ UV 광을 이용하여 DNA Band를 확인하고 이미지를 촬영하여 관찰한다.-----------------------------------------------------------------------------------------------------------5. 결과 및 고찰(가) 전기영동을 한 결과 (나) 첨가한 DNA Marker에 따른 전기영동의 결과(다) 농도에 따른 전기영동 결과의 차이 (라) 점착에 실패한 Well의 결과(가) 실험에서 사용한 시료의 양을 나타낸 표Well No.넣어준 시료9Loading Star 1muL + SiZer-1000 5muL10Loading Star 1muL + SiZer-100 5muL11Loading Star 1muL + PCR Product 5muL(나) 실험에서 사용한 시료의 양을 나타낸 표Well No.넣어준 시료3Loading Star 5muL4Loading Star 1muL + PCR Product 5muL5Loading Star 6muL + SiZer-1000 5muL11Loading Star 1muL + SiZer-100 5muL + PCR Product 5muL12Loading Star 5muL + SiZer-100 5muL + SiZer-1000 5muL5.1. 그림 (가) 에 대한 실험결과 및 고찰그림 (가)는 생성된 PCR Product의 길이를 확인하기 위해 DNA Marker의 종류인 SiZer-100, SiZer-1000 그리고 PCR Product를 마이크로 피펫을 이용하여 각각 5muL를 추출하여 Loading Star 1muL와 혼합하여 Well에 점착한 뒤 25분 동안 전기를 흘려보낸 후의 결과로 나타난 것입니다. 그림 (가)에서 11번을 보았을 때, 1개의 진한 선만 나타났으므로 다arose gel의 농도는 같으므로 길이가 짧은 base pair가 Well에서부터 멀리 관찰될 것입니다. 따라서 Well에서 멀리 떨어져 있는 10번이 SiZer-100 일 것이며, 10번에 SiZer-100 이므로, 9번은 SiZer-1000이라고 볼 수 있을 것입니다. 11번의 PCR Product의 base pair 수를 구하기 위해 9번과 10번에 DNA Marker를 넣었으며 SiZer-100을 넣은 10번을 보았을 때, 가장 위에 있는 선의 bp가 1500이고, 이 선의 위치가 11번의 선의 위치와 비슷하므로 반응시켜 생성된 PCR Product의 bp는 1500이라는 것을 알 수 있습니다.5.2. 그림 (나)에 대한 실험결과 및 고찰그림 (나)는 첨가한 DNA Marker에 따른 전기영동의 결과를 나타낸 것입니다. 3번, 4번, 5번은 실험 7조에서 실험한 결과이며 실험 8조의 실험결과는 11번, 12번으로 나타났습니다. 11번의 Well에는 1muL의 Loading Star와 5muL의 SiZer-100를 넣은 시료에 PCR Product 5muL를 추가로 넣었으며, 12번의 Well에는 1muL의 Loading Star와 5muL의 SiZer-100를 넣은 시료에 5muL의 SiZer-1000을 추가로 넣었습니다. 실험하기 이전에 들어간 시료의 종류를 고려하여 11번보다 12번에 더 많은 선이 나타날 것이라는 결과를 예상하였으며, 전기영동 실험을 끝낸 후 관찰한 결과는 예상한 결과와 같게 나타났습니다. 3번 Well에는 Loading Star만 넣었습니다. 때문에, 시료 중 DNA와 결합하는 특성을 가진 Loading Star가 결합할 DNA가 없었으므로 아무런 결과도 나타나지 않았습니다. 4번 Well에는 PCR Product와 Loading Star를 넣었습니다. 때문에, 형광으로 염색된 한 개의 선만 나타나게 되었습니다. 5번 Well에는 6muL의 Loading Star와 SiZer-1000을 넣었습니다. 평소 실험대로라면 1muL의 을 것이라 생각됩니다. 하지만 실험결과는 1muL를 넣든, 6muL를 넣든 비슷한 색깔이 나는 것으로 보아 염색이 되는 정도는 Loading Star가 결정하는 것이 아닌, DNA의 수가 결정하는 것임을 알게 되었습니다.5.3. 그림 (다)에 대한 실험결과 및 고찰전기영동 결과넣어준 시료12-DSiZer-100 5muL + SiZer-1000 5muL + Loading Star 1muL4-HPCR Product 5muL + Loading Star 1muL위의 표는 서로 농도가 다른 Gel에서 도출되는 결과를 찾아내기 위해 같은 시료를 넣은 Well을 찾아 분류한 표이다. 표를 보았을 때, 총 2가지의 공통된 시료를 넣은 Well을 찾아낸 것을 볼 수 있습니다. 표에 나타난 대조군을 그림 (다)에서 찾았을 때, 숫자가 쓰인 Well들은 영어가 쓰인 Well들에 비교해 그리 멀리 퍼져나가지 못한 것을 확연히 관찰할 수 있었습니다. DNA가 통과하는 Gel은 다공성으로 일종의 체와 같은 역할을 합니다. 따라서, Gel의 농도는 체가 얼마나 촘촘한지를 나타낸다고 보면 되겠습니다. 다시 말해서, 농도가 높은 Gel은 농도가 낮은 Gel보다 더욱 촘촘해서 DNA가 통과하기 어렵다고 생각하면 이해하기 쉬울 것입니다. 그 때문에, 숫자가 쓰여 있는 Gel의 농도가 영어가 쓰여 있는 Gel의 농도보다 진한 것을 결론으로 낼 수 있을 것입니다.5.4. 그림 (라)에 대한 실험결과 및 고찰그림 (라)는 실험을 하는 도중 한 실험자의 실수로 점착이 제대로 이루어지지 않은 Well이 전기가 흐름으로 인해 전기영동이 이루어진 결과입니다. 물론 그 안에도 DNA Marker를 넣었기에 여러 가지의 bp를 가진 DNA가 있을 것이고 전기영동이 이루어짐에 따라 층이 나뉘었으나, 점착이 균형 있게 이루어지지 않아 그 경계가 뚜렷하게 나오지 않았습니다. Well에 시료를 점착하는 것을 Loading이라고 하는데 Loading은 생화학실험에서 가장 섬세한 손기술을 요구하는 과정 중 하나라고 할 니다.
