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DNA Cloning - vector cloning

DNA CloningⅠ. Introduction1. 실험원리1) Gateway Cloning1990년대 후반부터 Invitrogen에 의해 발명되고 상용화된 Gateway cloning System은 재조합 sequence의 고유한 세트를 이용하여 연구자들이 DNA 조각을 플라스미드로 효율적으로 전달할 수 있게 하는 분자생물학적 방법이다. Gateway cloning System은 새로운 cloning 기술로서 DNA sequence, gene functional analysis, protein expression등에 적용이 가능하다. 또, site-specific recombination을 이용하여 DNA 단편의 vector간 이동을 가능하게 한다. 이 시스템은 기존의 제한 효소를 사용한 방식에 비해 손쉽고 빠르게 DNA 단편을 하나의 vector에서 하나 혹은 다양한 vector로 이동 가능하게 한다. 특히 이 시스템을 이용하게 되면 reading frame과 방향성을 그대로 유지한 상태로 gene이 이동하게 된다. 재조합 sequence의 고유한 세트는 "Gateway att" 자리와 "LR Clonase"와 "BP Clonase"라고 불리는 두 고유한 효소 혼합물로 이루어진다. Gateway Cloning 기법은 reading frame을 유지하면서 서로 다른 복제 벡터 간에 DNA 조각을 전달할 수 있게 한다. Gateway 를 이용하면 기능 분석을 위해 하위 clone DNA 단편을 복제할 수 있다. 이 시스템은 "Gateway Entry clone"(특유의 Invitrogen 명명법)을 만들기 위해 " att L 1"과 " att L 2"라는 두 개의 측면 재조합 sequence가 있는 플라스미드에 DNA 조각을 처음 삽입하는 것을 필요로 한다.인간, 마우스 및 쥐 ORF(open reading frames)의 대부분을 포함하는 Gateway Entry clones의 대규모 저장소는NIH(National Institute of Health) 기금(현을 위해)로 널리 채택되었다.Gateway cloning 의 첫 번째 단계는 Gateway Entry clone의 준비이다. Entry clones를 만드는 방법에는 세 가지가 있다. TOPO vectors나 PCR 증폭, restriction-enzyme vectors를 사용하는 것이 Entry clone을 만드는 가장 일반적인 방법이다.BP reaction을 통한cloning으로 Entry clones 만드는 과정은 보통 두 단계를 거친다:" Gateway atB1, attB2" sequences를 유전자 조각의 5'와 3' 끝에 각각 추가하며, gene specific PCR primers와 PCR 증폭을 사용한다.PCR 증폭 산물을 Gateway “Donor vectors” (Invitrogen 명명법)라고 하는 특수 플라스미드와 고유 "BP Clonase" 효소 혼합물과 섞는다. 효소 혼합물은 att-B-sequence-containing PCR 산물의 재조합과 삽입을 Gateway Donor vector의 att P 재조합 site에 촉매한다. 카세트가 표적 플라스미드에 속하게 되면, Gateway 명명법에서 "Entry clone" 이라고 불리며, 재조합 sequences를 Gateway “att L”형이라고 한다.Gateway Entry clone 의 유전자 카세트는 “LR Clonase”라는 고유한 효소 혼합물을 사용하여 그 어떤 Gateway Destination vector (promoters와 epitope tags같이 Gateway “att R” 재조합 sequences와 요소를 포함하고 있지만 ORF는 아닌 어떤 Gateway 플라스미드를 위한 Invitrogen 명명법) 안으로도 단순하고 효율적으로 전달될 수 있다. 수천 개의 Gateway Destination플라스미드가 만들어졌고 전세계의 연구자들 사이에서 자유롭게 공유되었다. Gateway Destination vectors 는 관심 유전자를 삽입하기 전에 제한 효소 diges sites 를 포함하는 Expression clone, 관심 flanking 유전자, 유전자 발현 준비.2) CRISPR/cas9 systemCRISPR란 DNA내에 존재하는 회문구조의 염기서열 중 하나인데, 처음에 이 염기서열은 어떤 역할을 하는지 뚜렷하게 드러나는 바가 없어 아무런 기능을 띄지 않은 무의미한 염기서열로 분류되어 왔다. 하지만 덴마크의 요구르트 회사 ‘다니스코’에서 유산균에 대해서 연구를 진행하던 로돌프 바랭고와 필리피 호바스 박사에 의해 이 CRISPR라는 회문구조의 염기서열이 우리 몸에서 적응면역의 기능을 한다는 것이 밝혀졌다. 이들이 밝혀낸 CRISPR구조의 적응면역기능을 이용한 것이 바로 3세대 유전자 가위인 CRISPR-CAS9이다.앞서 언급하였던 다니스코의 연구원들은 박테리오파지에 의해서 쉽게 사멸하는 유산균을 가지고 연구하던 도중 외부로부터의 박테리오파지의 유입으로 인해 대다수의 유산균이 사멸하고, 일부만 남게 되었고, 그들은 남은 일부의 유산균을 가지고 연구하면서 이런 유산균이 살아남을 수 있었던 이유에 대하여 탐구하기 시작하였다. 이 유산균 내의 CRISPR 회문구조는 기억과 면역 2가지로 나뉘어 적응면역의 기능을 한다. 우선 앞의 단계에서 침입한 박테리오파지의 DNA 일부를 CAS9단백질이 CRISPR 구조로 옮겨 박테리오파지에 대한 면역을 가진 염기서열을 형성하면, 이를 전사한 RNA(sgRNA라고 명명)와 CAS9단백질이 결합하여, sgRNA를 이용하여 침입한 박테리오파지를 찾아내 CAS9단백질을 이용하여 절단하여 면역기능을 한다. 여기서 영감을 얻은 미국 버클리대학교의 제니퍼 다우드나 교수와 독일 하노버대학교의 엠마뉴엘 카펜디어 교수는 다니스코의 연구원들이 발견한 적응면역의 기능을 하는 CRISPR구조가 박테리오파지 외에도 자신들이 원하는 염기서열을 sgRNA에 부착하면, 특정 염기서열을 절단해낼 수 있다고 생각하였고, 실제로 sgRNA가 박테리오파지 외에 다른 염기서열에서도 다음과 같은 작용을 하여, 이가 3세대 유 것을 방지하는 필수 표적 성분 (박테리아 게놈에서는 발견되지 않음)이다.정식 PAM은 서열 5'-NGG-3'이며, 여기서 "N"은 2 개의 구아닌 ("G") 뉴클레오 염기가 후속하는 뉴클레오 염기이다. Guide RNA (gRNAs)는 Cas9를 유전자 편집을 위해 게놈의 어느곳으로든 운반 할 수 있지만, Cas9가 PAM을 인식하는 곳 이외의 장소에서는 편집 할 수 없다. 정식 PAM은 Streptococcus pyogenes의 Cas9 핵산 분해 효소 (SpCas9로 명명됨)와 관련되는 반면, 다른 PAM은 박테리아인 Neisseria meningitidis, Treponema denticola 및 Streptococcus thermophilus 의 Cas9 단백질과 관련되어있다. 5'-NGA-3'는 인간 세포를 위한 매우 효율적인 non-canonical PAM이 될 수 있지만 효율은 게놈 위치에 따라 다르다. CRISPR-Cas9가 원하는 게놈 위치에서 유전자 편집을 수행하는 능력을 향상시키기 위해 Cas9s에 다양한 PAM을 인식시키려는 시도가 있었다.Francisella novicida의 Cas9 은 정규 PAM 서열 5'-NGG-3'을 인식하지만, PAM 5'-YG-3’을 인식 할 수 있도록 설계됨("Y"가 피리미딘인 곳에서)에 따라 가능한 범위의 Cas9 표적을 첨가한다. Francisella novicida 의 Cpf1 핵산 분해 효소 는 PAM 5'-TTTN-3 ' 또는 5'-YTN-3'을 인식한다. CRISPR-Cas9와 CRISPR-Cpf1을 제외하고도, 분명히 아직 알려지지 않은 핵산 분해 효소와 PAM이 많이 있다.세균 Leptotrichia shahii의 CRISPR / Cas13a (이전의 C2c2)는 DNA가 아닌 RNA를 표적으로 삼는 RNA 유도 CRISPR이다. PAM은 표적과 인접한 구아닌이 효능에 부정적으로 영향을 미치지만 RNA 타겟팅 CRISPR과 관련이 없으며 Protospacer Flanking Site (PFSn & 상층액 500ul 버림남은 LB media로 Pellet을 Pipetting 시킴LB Spec+ Plate에 도말 후 37℃ incubator O/NPlasmid DNA isolation(Mini Prep)Gel electrophoresis & SequencingⅢ. Result목 1조 목 3조결과분석Ligation 진행 후 Transformation 결과로, 각각 plate에 colony를 형성한 것을 볼 수 있다. 1조의 plate는 약 40개 안팎의 colony를 형성했고, 3조는 8개의 colony를 형성했다.Ⅳ. Discussion실험 결과, 1조와 3조의 colony 개수가 다른 것을 확인할 수 있었다. 1조의 plate는 약 40개 안팎의 colony를 형성했고, 3조는 8개의 colony를 형성했다. 3조의 colony 수가 더 적은 원인을 생각해보고자 한다.먼저, colony가 아예 형성되지 않았을 때를 가정해보면 원인으로 cell에 plasmid가 아예 들어가지 않은 empty vector가 들어간 경우와 ccd 제거가 되지 않은 donor vector가 들어간 경우가 있을 수 있다. cell에 empty vector가 들어간 경우는 transformation이 잘 못 된 경우이고, ccd를 가진 donor vector가 들어간 경우는 ligation 과정에서 문제가 생긴 것이라고 할 수 있다. 3조의 경우, colony가 아예 형성되지 않은 것은 아니므로 이 때에는 entry vector와 empty vector나 donor vector가 섞여 있다고 할 수 있다. ccd는 E.coli에서 발현되면 세포를 죽이므로, colony를 형성할 수 없다. 만약 BP reaction이 제대로 일어나지 못해 donor vector에 CTCF가 삽입되지 않았다면, ccd가 여전히 donor vector에 존재하므로 transformation 이후 colony를 형성하지 못했을 것이다. 따라서 3조의 plate에는 entry vector보다 don

자연과학| 2022.06.30| 10페이지| 1,000원| 조회(226)

DNA cloning, DNA 복제, CRISPR/CAS9 system, Ga..

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Gene silencing - DNA damage & DNA repair

Gene silencing ⅢⅠ. Introduction1. 실험원리1) Gene Silencing (유전자 침묵)유전자의 염기배열을 변화시키지 않고, 그의 발현을 인위적으로 억제하는 것 및 자연에 발생하는 발생억제도 지적하며, 유전자 전사단계에서인 억제와 전사 후 억제 등을 포함한다. RNA분자를 표적으로 하여 유전자 발현억제가 생기는 경우에는 RNA침묵(RNA silencing)이라고 부르며, 표적RNA에 상보적인 뉴클레오티드배열로 구성되는 두가닥 RNA로 구성되는 두 가닥 RNA가 특이적인 RN(A)(가수)분해효소Ⅲ에 의해 절단되어 생성되는 짧은(21~25 뉴클레오티드)의 RNA분자가 표적RNA분자 절단 또는 번역저해를 야기한다. 또, siRNA의 안테센스(antisense)사슬이 크로마틴 DNA에 작용하여 그 결과 크로마틴 변환복합체가 특정한 촉진인자영역을 표적으로 하여 작용하는 것으로서 헤테로크로미틴 형성을 하게 되어 전사단계에서 유전자발현이 억제하게 된다. 즉, 유전자기능 해석 등에 널리 이용하게 된다. 유전자침묵은 유전자조절(gene knockout)과 비교하면 조작이 간편하다는 것과 동시에 짧은 시간내에서도 발현억제효과를 얻어낼 수 있다는 것과. 완전히 유전자기능을 정지시키는 방법은 아니기 때문에 치사유전자 해석은 할 수 없는 등인 이점이 있다. 인위적인 유전자침묵으로서는 DNA/RNA법, RNA간섭(RNAi) 등이 알려져 있는데 그 중에서도 siRNA를 사용한 유전자조절(gene knockdown)인 RNAi는 간편함과 동시에 효율적으로 표적인 유전자발현을 억제할 수 있는 방법으로 주목되어 유전자의 기능해석 등에 널리 쓰여지고 있다. 유전자침묵은 암유전자를 억제시키기 위한 제암제로서 창역(創藥)분야에서도 기대되는 방법이다.2) Transfection정제한 파지의 핵산(DNA 또는 RNA)을 사용한 세균을 형질전환 하는데 있어, 형질전환(transformation)과 감염(infection)의 2용어로 합성한 조어이다. 이는 배양동물세포에 DNA한 염기 변형, 시토신 · 아데닌의 탈아미노화에 의해 생긴 우라실 · 히포크산틴산 등의 이상염기, 탈푸린 반응 결과 생긴 탈염기부위 등은 1염기의 손상이다. 자외선에 의해 동일 사슬 상의 이웃한 피리미딘간에 형성되는 2합체나 미토마이신C, 소라렌에 의한 이중가닥 간의 가교구조 등은 2염기에 변화가 미치는 것이다. γ선 등의 전리반사선은 염기뿐만 아니라 포스포디에스테르결합이나 당에도 널리 변화가 미치며, 한쪽 또는 양쪽의 사슬절단이 일어난다. 아미노벤조피렌, 아세틸아미노플루오렌 등의 복소환화합물은 초과산화물이나 히드록시라디칼을 발생하여 2차적으로 DNA에 대해 상술한 염기변화를 일으킨다.5) DNA repair세포의 염색체 DNA의 손상이나 DNA 복제할 때의 염기쌍 오류 등을 인식하여 이를 정상으로 회복시키는 기구. 유전정보를 갖는 DNA는 방사선이나 환경성 돌연변이원과 대사과정에서 생기는 활성산소 등에 의해 끊임없이 손상되고 있다. 이러한 손상은 DNA복제나 전사를 저해하며 세포가 죽고 동시에 돌연변이를 유발한다. 또한 복제 시에 잘못된 염기를 받아들여서(복제에러) 돌연변이가 생기며, 이러한 돌연변이는 유전정보를 변화시키고 나아가서는 발암, 노화, 유전적 결핍증의 원인이 되고 있다. 모든 생물은 이러한 DNA손상이나 복제착오를 회복하여 유전정보를 안정적으로 유지하기 위한 다양한 회복기구를 갖는다. 이 기구는 작용의 양식에서 다음과 같이 크게 나눌 수 있다. 먼저, 특수한 효소의 작용으로 DNA 상의 상처를 제거하는 것은 자외선으로 형성된 피리미딘2합체를 광회복효소의 작용으로 원래의 피리미딘으로 정상화하는 광회복이나 알킬화제의 작용으로 메틸화한 DNA염기로부터 메틸기를 제거하는 메틸기전이효소에 의한 회복이 이것에 해당한다. 제거수선은 손상된 염기를 포함한 뉴클레오티드의 일부를 절단해서 정상인 다른 쪽의 DNA사슬을 주형으로 수선합성에 의해 원래대로 회복되는 기구이다. 이것에는 우선 손상염기를 제거하여 비교적 짧은 부분의 수선합성을 하는 염기제거 수선과 손상된 DNA-PKcs)의 동족체들은 이 인산화, 특히 ATM을 담당한다. 이러한 수정은 replication fork 또는 이온화 방사선에 대한 반응에서 우발적으로 발생할 수 있지만 V(D)J 재조합과 같은 통제된 생리적 과정에서도 발생할 수 있다. γH2AX는 세포에서 DSB를 보기 위한 민감한 대상이다. 그러나 γH2AX의 존재 자체는 DSB의 증거가 아니다. DNA 수리에 있어서 히스톤의 인산염 형태의 역할이 논의되고 있지만, 수정으로 인해 DNA가 덜 응축되어 잠재적으로 DSB 수리에 필요한 단백질의 채용을 위한 공간이 가능한 것으로 알려져 있다. 돌연변이 유발 실험은 이중 가닥 파손에 대한 대응으로 이온화 방사 유도 초점의 적절한 형성을 위해 변경이 필요하지만, DSB 현장에 단백질을 모을 필요는 없다는 것을 보여주었다.Ⅱ. Material & Method1) Formaldehyde밀도 1.067(공기 1.000 기준). 녹는점 －92℃. 끓는점 －19.5℃. 인화점 약 300℃. 상온에서 가연성인 무색의 기체. 호흡이 곤란할 정도로 강력한 자극적인 냄새를 방출한다. 점막에 강력한 자극성을 나타내며 발열성이 있다. 55%까지는 물에 녹지만 알코올이나 에테르에는 녹지 않는다. 반응성이 매우 커서 여러 물질과 쉽게 중합한다. 환원성이 강하기 때문에 환원시약으로서 검출이나 정량용으로 주로 사용한다. 약 40%수용액을 포르말린이라 하고, 소독, 방부제, 조직고정제 등으로 사용한다. 포르말린에는 10~15%의 메탄올이 중합저해제로 포함되어 있다.2) Digitonin녹는점 225℃ (습윤), 235~240℃(불명확). 현삼과식물 디지털리스의 종자와 잎에서 얻을 수 있는 스필로스탄골격을 갖는 사포닌. 무색 결정. 무기산에서 가수분해하면 디지토게닌, 포도당 · 갈락토오스 각 2분자, 크실로오스가 생긴다. 강한 용혈성, 발포성이 있는 어독(魚毒)이 된다. 알코올 중 3β-히드록실기가 있는 스테롤, 고급알코올, 페놀과 난용성인 포접화합물(디지토니드)을 형성하므로 효소법이kdown 시키면 protein Y가 활성하지 못한다는 것을 알 수 있다. 이를 통해 protein Y가 CTCF보다 downstream에 있는 protein이라는 것을 알 수 있다. 따라서 protein X → CTCF → protein Y 순으로 작용한다고 유추할 수 있다. CTCF를 knockdown시켜도 protein X는 영향을 받지 않고 잘 활성할 수 있는 반면, protein Y는 CTCF의 활성에 영향을 받는 단백질이기 때문에 CTCF를 knockdown시키면 활성화되지 못한다. 만약 protein X를 knockdown 시켰다면, CTCF와 protein Y는 둘 다 활성하지 못했을 것이다. 그러나 반대로 protein Y를 knockdown 시켰다면, protein X와 CTCF는 활성했을 것이다.사진 3과 4의 shCTL과 shCTCF 결과를 비교해보면, shCTCF가 shCTL에 비해 전체적으로 흐리게 발광한 것을 볼 수 있다. shCTCF는 CTCF를 knockdown 시킨 DNA이므로 shCTCF의 CTCF는 모두 흐리게 발광한 것을 볼 수 있다. γH2AX는 DSB에 대한 반응으로 나타나므로 사진3의 γH2AX 발광 site는 DNA repair가 진행되고 있다고 추측해 볼 수 있다. 또한 foki는 DNA damage가 일어난 곳에서 나타날 것이므로, 사진4에서 foki가 발광한 곳에 damage가 일어났음을 알 수 있다.Ⅳ. DiscussionDNA 손상은 DNA 증폭 반응 (DDR)이라고 하는 진화적으로 보존 된 센서, 매개체 및 작동기 네트워크를 유도하여 손상을 감지하고 신호 증폭 계단식으로 신호를 세포 전체에 전파한다. 그 결과 손상된 DNA로부터의 딸 세포 복제 및 전달을 막고 DNA 수리 경로 조정하기 위해 세포주기 과정이 느려지거나 저해된다. 단일 가닥 DNA와 DSB는 병변에 모여 두 개의 큰 단백질 ATR과 ATM을 활성화하는 특수 복합체에 의해 감지되어 히스톤 변종 H2AX의 국소 인산화가 발생한다. 인산화 H2Actasia (AT) 환자의 경우처럼 etoposide에 대한 과민반응이 나타나며, 특히 AT 세포에서 G2 / M 체크 포인트 손실은 복구되지 않은 etoposide-induced DNA 파손이 발생하더라도 체세포 분열이 진행되어 염색체 이상을 초래한다. Etoposide에 의해 유발된 ATM kinase의 활성은 결과적으로MRN (Mre11/Rad50/NBS1) 복합체를 포함하고 ionizing radiation-induced foci (IRIF)와 구별하기 힘든 subnuclear repair foci의 형성을 유도한다. MRN 복합체와 γH2AX를 포함한 DNA repair 인자의 중심적 축적은 DNA 손상 반응의 중요한 세포학적 신호이다.사진 3의 DAPI staining shCTL 결과와 shCTCF 결과를 비교해보면, 상대적으로 shCTCF가 훨씬 더 흐린 양상을 띈다. DAPI는 주로 DNA strands 사이에 끼어서 결합하여 형광으로 발광하는데, DAPI가 DNA와 많이 결합할수록 형광의 발광도가 더 높아지게 된다. CTCF를 knockdown시킨 shCTCF는 etoposide 처리 후 DNA strand breaks가 된 DNA를 repair 할 수 없기 때문에 CTCF를 통해 DNA repair가 일어나고 있는 shCTL보다 DSB가 많아 DAPI가 잘 결합하지 못해 발광이 흐리게 된 것이다. shCTL도 발광이 진하게 잘 되었다고 할 수는 없는데, 이 또한 etoposide 처리 후 DSB가 일어나 DAPI가 DNA strands 사이에 끼지 못해서 생긴 결과라고 생각한다.사진3의 shCTCF의 CTCF와 γH2AX의 발광은 흐린 데 비해 shCTL에서의 CTCF와 γH2AX의 발광은 잘 나타나는 것을 확인할 수 있다. 따라서 CTCF가 γH2AX의 발현에도 영향을 끼친다고 추측해 볼 수 있다. DSB가 생기면 ATR과 ATM에 의해 H2AX의 인산화가 발생하는데 이것을 γH2AX라 하고 γH2AX는 damage marker로서 작용한X’

자연과학| 2022.06.30| 12페이지| 1,000원| 조회(188)

Transfection, gene silencing, DNA repair, 면..

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Gene silencing - Western blot & CTCF knockdown

Gene silencing ⅡⅠ. Introduction1. 실험원리1) Western blot특정 단백질의 유무 또는 양을 알기 위해 수행하는 분석방법이다. 주로 단백질의 발현 여부를 알기 위해 사용한다. 서던 블랏(southern blot)과 노던 블랏(northern blot)이 DNA-DNA, DNA-RNA간의 특이성을 이용하는 데 반해 웨스턴 블랏은 단백질-단백질간의 특이성을 이용한다. 주로 항원-항체(Antigen-Antibody)반응을 이용한다. 항원-항체(Antigen-Antibody)반응을 이용하기 때문에 매우 높은 특이성을 지닌다. 먼저 젤을 만드는데, 젤은 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 젤에 SDS를 넣은 것을 사용한다. Polyacrylamide, SDS, Ammonium persulfate, TEMED를 틀에 넣어 굳혀서 젤을 만든다. 굳히는데 30분정도 기다린다. 장치에 loading buffer를 채운다. 단백질은 5분간 90도에서 denaturation시킨다. 단백질을 loading 하기 전 well을 씻어준다. 단백질을 loading한다. 혼합단백질을 SDS-PAGE에 전기영동한다. 전기영동이 끝난 후 젤을 Transfer buffer에 넣는다. Transfer는 단백질을 나일론 막으로 옮기는 작업이다. Transfer membrane을 젤 크기에 맞추어 자른다. 나일론 membrane을 순수한 메탄올에 적신다. 몇 분 후 paper2장, membrane, gel, paper2장의 순서로 겹쳐 놓는다. (단백질이 아래쪽으로 이동할 것을 가정하였을 때) 판 위에 Transfer buffer를 적신다. 100V에서 90분간 transfer한다. Transfer한 후, blocking을 진행한다. TBS로 membrane을 15분간 2회 washing 후 1% BSA-TBST에 1~2시간 혹은 5% non-fat dry milk에 30분간 담가둔다. Blocking 후, 항체반응을 진행한다. TBST로 15분간 2회 w사 억제자(Transcriptional repressor) CTCF는 11-zinc finger protein로서 알려져 있다. 혹은CCCTC-binding factor은 인간 사이에서는 CTCF gene를 암호하고 있는 전사인자(transcription factor)로 알려져 있다. CTCF는 전사조절, insulator activity, V(D)J recombination, chromatin architecture 조절 등 많은 세포 과정에 관여한다. CTCF의 주된 역할은 chromatin의 3차원 구조를 조절하는 것이다. CTCF는 DNA와 함께 결합하고 있어, chromatin loops와 핵 라미나와 같이 세포 구조물과 함께 anchors DNA를 형성한다. 이것은 활성화되어 있는 heterochromatic DNA에서 작용한다.4) 표현형 확인 방법탐침특정물질, 부위, 상태 등을 특이적으로 검출하는 물질을 총칭. 예를 들면 핵산의 상보적인 염기배열에서 서로 간에 특이적으로 결합하는 물질을 이용하여 클론 라이브러리 내에서 특정한 배열을 하고 있는 클론을 검출한다거나, 전기영동에 의해 전개된 DNA나 RNA단편에서 특정한 단편을 검출하는 올리고뉴클레오티드 DNA나 RNA탐침 등이 있다. 또 항원, 항체반응의 특이적 결합을 이용하여 특정한 항원을 검출하는 항체탐침 등이 있다.ELISA(엘라이사)효소결합면역흡착제 검정법으로 번역되고 있다. 이 법은 항원(또는 항체)에 알칼리성 포스파테이스 또는 페르옥시데이스 등의 산소를 결합시켜 두고 그 산소활성을 지표로 삼아 항원항체반응의 정도를 안 다음 여기에서 항원(또는 항체)의 양을 구하는 것이다. 이 법의 이점으로서 고감도, 조작의 간단함 및 라디오이무노아세이처럼 방사성물질을 사용하지 않아도 된다는 점을 들 수 있다. 호르몬이나 면역글로불린의 정량법으로서 응용이 되고 있으며, 측정용 키트도 시판되고 있다.Northern blotNorthern blot, 즉 RNA blot은 분자 생물학 연구에서 Sample에서 아니라 화학, 반도체, 의료 및 방위 산업에서도 흔히 사용된다. 또한 항공 및 항공 우주 분야에서 점점 더 많이 사용되고 있는 밀폐된 셀 폼으로 사용될 수 있다. 또한 식품과 반복적으로 접촉할 때도 사용될 수 있는데, FDA의 규정을 준수하고 절대적으로 독성이 없기 때문이다. PVDF 막은 아미노산에 대한 특정하지 않은 친화성 때문에 단백질의 고정을 위한 서양 블로프에 사용된다. PVDF는 탄소 전극 초전도기 및 기타 전기 화학적 용도의 바인더 구성 요소로도 사용된다.Ⅱ. Material & Method1) 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide)단백질이나 핵산의 전기영동용 담체로서 불가결한 소재. 아크릴아미드를 중합시킨 섬유상 고분자이지만 보통은 N,N′-메틸렌비스아크릴아미드를 공중합하여 섬유간에 가교를 도입한다. 친수성이 크기 때문에 물 속에서 잘 팽윤하여 3차원의 그물눈을 만들어 겔화한다. 실험실에서 간단히 만들 수 있으며 투명하고 비특이적 흡착은 적다. 아크릴아미드 및 가교제의 농도를 변화시켜 그물눈의 크기를 조절할 수 있다는 등의 장점이 있다.2) SDS(도데실황산나트륨)생화학분야에서 가장 많이 사용되는 계면활성제의 일종. 곧은사슬 모양인 도데실알코올의 황산반에스테르의 나트륨염인 [CH3(CH2)11OSO3－Na＋]. 야자기름에서 얻는 고급 알코올 혼합물을 분류(分溜)하여 얻은 도데실알코올을 황산화하여 제조한다. 단백질에 대해 강력한 고친화성이 있어 동일 중량 이상의 도데실황산나트륨이 결합하여 단백질을 변성시키며 이 산물은 분리분석용 시료로 매우 유용하다. 때로는 물에 난용성인 물질, 특히 생체막단백질을 물에 가용화하기 위해 사용하기도 한다. 순수에서는 8mM(완충액에서는 그 이하의 농도)을 초과하면 미셀을 형성하고 단분자상으로 녹아 있는 것의 농도는 한계점에 이른다. 용해도는 상당히 높지만, 10℃ 이하에서는 미셀 형성능을 상실하기 때문에 급격히 저하된다.3) TBS (Tris-buffered saline)Tris-buffered saline결합, 6 개의 방향족결합, 1 개의 6원자 고리 그리고 1 개의 방향족 수산기로 구성되어 있다.7) RIPA buffer (Radioimmunoprecipitation assay buffer)Cell이나 조직을 분해하는데 사용되는 lysis buffer이다. 이 완충용액은 NP-40나 Triton X-100 lysis buffer보다 더욱 변성시킨다. 왜냐하면 ionic detergents SDS나 sodium deoxycholate를 포함하고 있고 nuclear extracts를 준비하기 위해 핵막을 파괴하는데 부분적으로 용이하다.8) Ponceau 3R화학식은 C19H16N2Na2O7S2이고, 분자량은 494.46이다. 이는 셀룰로오스아세트산막 등을 지지체로 한 혈청단백질의 전기영동을 시행한 후 밴드를 염색하는 데 사용하는 물질이다. 암홍색으로 물에 잘 녹는다. 단백질의 정의 전하 및 소수기 등과 결합한다. 6% 트리클로로아세트산용액에 1분 30초 가량 침지한 후, 아세트산용액으로 탈색한다. 염색이 지나치면 탈색이 잘 되지 않는다. 감도는 쿠마시-브릴리언트블루(Coomassie brilliant blue)보다는 1자릿수가량 불량하다.1) Cell lysis (2days after transfection)2) Measuring Protein3) SDS-PAGELysate/ExtractsPour Gel and assambling devicePipet samples and bufferElectrophoresisSeparated protein bands4) Transfer to membrane5) Blocking6) Primary antibody7) Secondary antibody8) Blotting* Preparing a PA-gel- Separating Gel1. 만들고자 하는 Gel의 농도에 따라 reagent들을 혼합한다 (Temed는 제일 나중에 넣어준다.)2. Pipetaid를 사용하여 미리 준비한 유리판 사이로 넣어준다.3. DW 700ul정도를 r가 많을수록 6조와 같은 CTCF의 발현을 나타내게 된다. 따라서 2조>5조>1조>4조>3조>6조 순으로 shRNA가 잘 inserting 되었고, 이에 따른 RNA interference를 통해 CTCF를 knockdown시키는 결과값이 차이를 나타낸다고 할 수 있다.또한 Alpha Tubulin의 발현양을 통해 실험의 신뢰도를 판단할 수 있다. Alpha Tubulin은 Housekeeping Gene으로 항상 동일한 발현양을 나타내야 한다. Housekeeping Gene이란 세포 생존에 필수불가결한 유전자로 어떠한 상황에서도 일정하게 발현되는 유전자를 의미한다. 만약 Western blot 결과 Alpha Tubulin band가 흐리게 나타났다면, 이는 신뢰할 수 없는 결과가 된다. 예를 들어 2조의 경우 CTCF band는 흐리지만 Alpha Tubulin band는 일정한 발현양을 나타냈으므로 CTCF knockdown이 잘 되었다고 할 수 있다. 그러나 Alpha Tubulin band 또한 흐리게 나타났다면 CTCF가 제대로 knockdown 되었다고 할 수 없는 것이다. 이러한 경우 CTCF와 Alpha Tubulin band를 흐리게 나타낸 원인이 되는 다른 요인을 찾아야 한다.만약 Western blot 결과, 모든 CTCF와 Alpha Tubulin band가 나타나지 않았다면 blotting 과정에서 2차항체가 1차항체에 결합하지 못하고 모두 washing 된 경우를 생각해 볼 수 있다. 이 때에는 넣어준 2차항체가 1차항체와 특이적으로 결합하는지 다시 확인하고, 만약 결합하지 못한다면 1차항체와 특이적으로 결합하는 2차항체를 찾아 다시 실험해야 할 것이다. 또, 2차항체가 1차항체에 결합했으나 아예 활성 하지 못한 경우도 있을 수 있다. 이 때에는, 2차항체를 luminol과 반응시켜 빛이 나오는지 확인해보고 빛이 안 나온다면 2차항체를 바꿔서 다시 실험해야 한다. 반대로 ECL solution이 오염된 경우가 있을 수 있다. 이 ’

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SDS-PAGE, Western blot, shRNA, CTCF

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Gene silencing - Plasmid DNA isolation(Mini Prep)

Gene silencing ⅠⅠ. Introduction1. 실험원리1) Gene cloning (유전자 클로닝)유전자도서관에서 원하는 유전자를 선발하는 것을 뜻한다. 선발방법은 원하는 유전자를 포함하고 있는 유전자집단을 숙주세포 내에서 파지나 플라스미드 등의 자기증식이 가능한 매개체에 끼워 넣어 재조합DNA를 제작한다. 다음에 재조합DNA를 대장균 등의 숙주세포에 이식하여 숙주를 형질전환시킨다. 형질전환된 세포집단에서 원하는 유전자를 포함하고 있는 것을 선발하는 것이다. 형질전환된 숙주를 배양해서 얻는 세포집단은 원하는 유전자 외의 DNA를 포함하는 것이 대다수이므로 원하는 유전자에 관한 정보 등을 지표로 하여 원하는 재결합DNA를 포함하는 클론을 분리해야 할 필요가 있다.2) Gene Silencing (유전자 침묵)유전자의 염기배열을 변화시키지 않고, 그의 발현을 인위적으로 억제하는 것 및 자연에 발생하는 발생억제도 지적하며, 유전자 전사단계에서인 억제와 전사 후 억제 등을 포함한다. RNA분자를 표적으로 하여 유전자 발현억제가 생기는 경우에는 RNA침묵(RNA silencing)이라고 부르며, 표적RNA에 상보적인 뉴클레오티드배열로 구성되는 두 가닥 RNA가 특이적인 RNA가수분해효소Ⅲ에 의해 절단되어 생성되는 짧은(21~25 뉴클레오티드)의 RNA분자가 표적RNA분자 절단 또는 번역저해를 야기한다. 또 siRNA의 안테센스(antisense)사슬이 크로마틴 DNA에 작용하여 그 결과 크로마틴 변환복합체가 특정한 촉진인자영역을 표적으로 하여 작용하는 것으로서 헤테로크로미틴 형성을 하게 되어 전사단계에서 유전자발현이 억제된다. 즉, 유전자기능 해석 등에 널리 이용하게 된다. 유전자침묵은 유전자조절(gene knockout)과 비교하면 조작이 간편하다는 것과 동시에 짧은 시간 내에서도 발현억제효과를 얻어낼 수 있다는 것과 완전히 유전자기능을 정지시키는 방법은 아니기 때문에 치사유전자 해석은 할 수 없는 등인 이점이 있다. 인위적인 유전자침묵으로서는 DNA/분해한다. RNAi에는 RNA에서 새로운 RNA합성이 필요하다는 것을 시사하여 silencing개시, 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 생각하고 있다. RNA의존성 RNA중합효소(RdRp)는 외가닥(single-stranded: ss) RNA에서 dsRNA을 합성하는데 필요한 효소라고 할 수 있다. RNAi는 유전자발현의 강한 억제는 가능하지만 null allele(비대립유전자)를 얻어낸다는 것은 곤란하다는 점, 또한 RNAi가 비효율적으로 알려져 있는 점도 남아 있지만, 간편하고 효과적인 유전자발현 억제기법의 하나로 되고 있다.4) siRNA vs shRNA- siRNA짧게 합성된 dsRNA(siRNA)를 바로 세포 내로 tranfection시키는 방법이다. Transfection된 RNA는 cell 내에 있는 RISC와 결합되며, 이 때 unwind 상태가 되어 target gene의 degradation을 유도한다. 빠르게 knockdown을 관찰할 수 있고, 따로 cloning 등의 실험과정이 필요 없어 실험과정이 간편하며 transfection 되는 양이 많아 transfection efficiency가 높다는 장점이 있다. 그러나 짧은 시간 동안만 유지가 가능하며 비용이 많이 든다.- shRNAplasmid vector에 cloning 하여 transfection 후 cell 내에서 발현을 유도하는 방법이다. strong promoter를 이용하여 발현된 short hairpin RNA(shRNA)를 포함한 vector를 transfection시켜 발현되는 shRNA transcripts는 double-stranded, stem-loop structure를 형성한다. 이 hairpin은 Dicer에 의해서 smaller fragment로 잘려져 RNAi system에 적용되게 된다. Transient expression은 물론, stable cell line development가 가능하여 long term expression 모두 가능하다. vir 탐구하기 시작하였다. 이 유산균 내의 CRISPR 회문구조는 기억과 면역 2가지로 나뉘어 적응면역의 기능을 한다. 우선 앞의 단계에서 침입한 박테리오파지의 DNA 일부를 CAS9단백질이 CRISPR 구조로 옮겨 박테리오파지에 대한 면역을 가진 염기서열을 형성하면, 이를 전사한 RNA(sgRNA라고 명명)와 CAS9단백질이 결합하여, sgRNA를 이용하여 침입한 박테리오파지를 찾아내 CAS9단백질을 이용하여 절단하여 면역기능을 한다. 여기서 영감을 얻은 미국 버클리대학교의 제니퍼 다우드나 교수와 독일 하노버대학교의 엠마뉴엘 카펜디어 교수는 다니스코의 연구원들이 발견한 적응면역의 기능을 하는 CRISPR구조가 박테리오파지 외에도 자신들이 원하는 염기서열을 sgRNA에 부착하면, 특정 염기서열을 절단해낼 수 있다고 생각하였고, 실제로 sgRNA가 박테리오파지 외에 다른 염기서열에서도 다음과 같은 작용을 하여, 이가 3세대 유전자 가위인 CRISPR-CAS9으로 발전하게 되었다. CRISPR-CAS9이 1세대(ZFN), 2세대(TALEN)과 가장 큰 차이는 바로 염기서열을 찾는 역할을 하는 것이 단백질에서 RNA로 바뀌었다는 것인데, 단백질의 경우 고분자물질이기 때문에 덩치가 꽤 큰 단백질을 연구자가 자신이 원하는 서열을 자르기 위해서 수천 개의 새로운 인공 유전자로 적절한 단백질을 만들어야 했다. 하지만 CRISPR-CAS9에서 사용된 RNA의 경우 몇 가지 염기서열만 조작해주면 되어 연구자가 원하는 최적의 구조를 형성할 수 있게 되었으며, 대량생산이 가능해졌다는 점에서 이전의 유전자 가위에 비해 매우 혁신적인 발전을 이루었다.6) PNKPolynucleotide 5'-hydroxyl-kinase로, ATP + 5'-dephospho-DNA를 ADP + 5'-phospho-DNA로 바꾸어 5‘에 인산기를 붙여주어 DNA가 결합할 수 있게 한다. PNK는 ATP로부터 DNA나 RNA 5’ 말단의 자유로운 히드록실기로 감마-인산염의 전달을 촉매하는 T7 박테리오파지(noglobulin 항체 생성의 재조합 과정, 유전자의 Alternative splicing 등에도 관여한다고 보고되었다.Ⅱ. Material & Method1) Primer design2) Vector cloningEnzyme cuttingLigationTransformationPlasmid DNA isolation(Mini Prep)Innoculation이 끝난 E.coli centrifuge 8000rpm 5minTube 1개당 resuspension buffer 250ulLysis buffer 250ul in 5-10회 inverting (not Vortexing)Nentrulization buffer 350ul in 5-10회 inverting. Centrifuge 13,000rpm 10minPipet으로 상층액(850ul) 분리하여, 파란색(gene JET Spin Columns & Collection tube) 넣기Centrifuge 13,000rpm 10minFlow-through 제거 후, Wash buffer 600ul, centrifuge 13,000rpm 1minWash buffer 300ul, centrifuge 13,000rpm 2minSpin-column을 1.5ml tube에 inColumn 가운데 elution buffer or D.W 40ul 넣고 2min 기다림Centrifuge 13,000rpm 1minO.D 측정 후 Recutting 하고, 나머지는 –20℃ 보관Enzyme re-cuttingSequencing3) TransfectionⅢ. Result결과분석Size marker를 기준으로, 나와 2조의 band 크기는 280bp로 추정된다. 1조는 그 보다 약간 작은 270bp, 3조는 230bp, 4조와 5조는 약 260bp, 6조의 band 크기는 250bp 정도로 추정해 볼 수 있다. Insert vector는 281bp, empty vector의 band 크기는 227bp로, 전기영동 결과 empty vector가한 경우이다. Plasmid의 BglⅡ와 HindⅢ site를 제대로 자르지 못하여 oligo가 insert 되지 못했을 수 있다. 혹은, enzyme의 활성이 약했거나 vector의 양이 많아 일부 vector가 잘리지 않았을 수도 있다고 생각한다. 이러한 vector는 oligo를 insert 할 수 없으므로 empty vector 상태로 남아있었을 것이다.또 다른 원인으로는 vector cutting 후 CIP 처리 과정에서 CIP가 활성을 잃어 제 기능을 하지 못한 경우이다. CIP(Calf Intestine Phosphatase)는 탈 인산화 효소로 vector의 인산기를 떼어내는 역할을 한다. Vector를 enzyme으로 자르면 DNA 양끝의 5'에는 phosphate가 붙어 있어 DNA ligase를 넣어주었을 때 서로 붙는 self-ligation을 하게 된다. 하지만 이 phosphate를 CIP 처리 해 주면 phosphate는 떨어져 나오게 되어 DNA 말단이 ligase에 의해 붙을 수 없게 된다. 즉, phosphate를 갖는 insert을 넣어주기 전까지 ligation 할 수 없다. 그러므로 이 CIP가 제대로 활성되지 못했다면 vector가 self-ligation 되었을 확률이 크다.결론적으로 band가 280bp에 가깝게 나온 나, 1조, 2조의 plasmid는 oligo가 확실히 inserting된 insert vector이고, 3조의 plasmid는 oligo가 inserting 되지 않은 empty vector라고 생각한다.또, 2조의 band가 희미한 이유는 re-cutting과정에서 시약의 volume을 잘못 넣었기 때문이다. protocol대로라면 plasmid 1ul, mix(10x enzyme buffer, Enzyme 1, Enzyme 2, DW) 9ul을 넣어주어야 하는데, 2조의 경우 plasmid 1ul, mix 1ul, DW 8ul을 넣어주었다. 따라서 증류수로 mix를 희석한 셈이 된다. Enzyme134.

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gene silencing, RNA interference, 유전자 클로닝, siRNA

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MTT assay

MTT assayⅠ. Introduction1. 실험원리1) 세포 독성 시험(Cytotoxic test)어떤 표적 세포에 세포표면의 항원에 대한 특이항체와 보체를 반응시킨 경우에 생기는 세포막의 투과성 변화, 핵의 손상을 포함한 표적세포의 상해를 세포 밖에서 측정하여 그 활성을 평가하는 시험이다.-Tetrazolium saltTetrazolium salt는 3개의 aromatic ring이 연결된 heterocyclic compound의 통칭으로mitochondria 내에서 enzyme에 의해 metabolize 되어 formazan이라는 물질을 생성한다. 이것을 녹이면 색깔을 띄므로 이 formazan의 양을 absorbance로 정량적으로 측정할 수 있다는 점을 이용하여 cell의 proliferation 정도를 측정한다. 주로 이용되는 tetrazolium salt로는 MTT, XTT, MTS, WST-1 등이 있다.그림1. Tetrazolium salt의 기본구조2) MTT assay (MTT = 3- (4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)세포 독성을 측정하는 실험법 중 하나로 MTT(노란색)가 효소(mitochondrial succinate dehydrogenase) 반응에 의해 formazan(보라색)으로 환원되는 정도를 색의 변화로 판별하는 실험법이다. Sample 처리 후 MTT를 분주하면 MTT는 cell 내부로 들어가 mitochondria에서 insoluble 형태로 환원이 된 formazan을 만들게 된다. 여기에 DMSO 같은 유기용제를 넣어주게 되면 cell이 용해되면서 마찬가지로 용해된 formazan product가 방출되게 된다. 이 때 보라색을 나타내게 되며 spectrophotometer로 특정 wavelength에서 파장을 측정하게 된다.그림2. MTT assay3) DMEMDMEM은 가장 일반적으로 사용되는 동물 세포 배양용 배지이다. 세포 배양시 DMEM만 놓고 보면 아미노산, 비타민, 무기염분, 포도당, 지질, 그리고 지시약이 들어간다. 그리고 세포를 배양하기 위해 혈청을 10% 정도 넣어주어야 한다. 그 후 중요한 것이 항생제이다.4) DMSO (Dimethyl Sulfoxide)무색무취의 흡습성의 액체로 각종의 유기물질에 대한 뛰어난 용제이다. 동해보호제로서 배양세포 등의 동결보존에도 사용된다.그림3. DMSO 구조5) Ethyl Alcohol (에탄올)에탄올(ethanol)은 무색의 가연성 화합물로 알코올의 한 종류이며, 술의 주성분이다. 화학식은 C2H5OH, C2H6O, CH3CH2OH이다. 물 또는 에테르와 섞일 수 있다. 태울 경우 투명하고 옅은 푸른색을 띤 화염을 발생시키며, 물과 이산화 탄소가 만들어진다. 증기는 폭발성이며, 이를 이용하여 일부 내연기관에서 연료로 사용되기도 한다. 에탄올은 알코올성 음료 산업의 기반이며, 공업적으로 여러 공정에 개입되며, 용매, 소독제, 연료 등으로 많이 사용된다. 또, 에탄올은 단백질을 응고시키므로 소독 및 살균 작용이 있다. WHO 가이드라인에서는 에탄올 80%이상으로 손 소독을 하라고 명시하고 있다. 에탄올을 먹을 경우 대뇌의 기능 억제로 인하여 흥분상태가 되고, 이후 중추신경억제의 효과가 나타난다. 에탄올이 함유된 알코올성 음료를 지나치게 자주 마시면 습관성이 생기고 중독에 이른다.Ⅱ. Material & Method[MTT 시약 제조 (MW : 44.33)]• 5mg/mL의 농도로 PBS에 녹여 사용한다.• 완전히 녹으면 0.2㎛ 정도로 filtering 하여 사용한다.• MTT 시약은 빛에 약하므로 호일을 씌우거나 빛을 차단하여 보관한다.[실험방법]① MTT 시약을 호일로 감싸둔다.․이때 media는 FBS가 포함되지 않은 media를 사용한다.② 미리 물질을 처리해둔 세포를 준비한 뒤, MTT 시약을 200μL씩 처리한다.․MTT 시약을 처리할 때는 충분히 섞어주면서 처리한다.․MTT 시약을 세포에 처리할 때 너무 세게 넣으면 세포가 손상되므로 천천히 넣어준다.③ 시약 처리 후 37℃에서 30min incubation 해준다.④ MTT 시약을 제거한 후 DMSO를 well당 600μL씩 넣어준다. DMSO에 formazan이 골고루 녹아 보라색으로 발색될 수 있도록 한다.⑤ 540nm에서 흡광도를 측정한다.Ⅲ. Result사진1. 흡광도 측정 전 96 wellⅣ. DiscussionMtt assay 결과, Ethyl alcohol 10ul 처리한 cell > Control > Ethyl alcohol 100ul 처리한 cell > Ethyl alcohol 200ul 처리한 cell 순으로 높은 흡광도를 나타냈다. 이는 Ethyl alcohol을 10ul 처리한 cell이 가장 많이 살아있음을 의미한다. 반면에 Ethyl alcohol을 200ul 처리한 cell은 살아있는 세포가 가장 적다는 것을 의미한다.이 결과를 통해 처음에는 Ethyl alcohol을 10ul 정도 처리하는 것은 세포에 크게 영향을 미치지 않을 것이라고 추측했다. 그러나 Ethyl alcohol 10ul 처리한 cell의 T-test 값이 0.024로 유해성이 있다고( Ethyl alcohol 10ul 처리한 cell > Ethyl alcohol 100ul 처리한 cell > Ethyl alcohol 200ul 처리한 cell 순으로 높은 흡광도 값을 나타내야 된다고 생각한다.반면 Ethyl alcohol이 100ul과 200ul이 있을 때는 세포 수가 확연히 줄어드는 것을 관찰할 수 있었다. 특히 T-test 값을 비교했을 때, Ethyl alcohol을 200ul 처리한 cell의 값이 0.003을 나타내므로 확실히 유해성이 있다고 평가할 수 있다.또 이번 실험에서는 FBS가 포함되지 않은 media를 사용했는데, 이는 FBS가 세포 독성 평가에 영향을 미칠 수 있기 때문이라고 생각한다. 비록 항체가 얼마 없다고 해도, FBS에는 여러 가지 성분이 포함되어 있을 것이다. 따라서 Serum free media를 사용하여 실험해야 Ethyl alcohol이 100% 제 기능을 할 수 있을 것이라고 생각한다.Ⅴ. Reference-박상대, 분자세포생물학, 아카데미서적, 1998, p.12-13-조문구, 배양공학, 유한문화사, 2004, p.195-Wikipedia ‘Ethyl Alcohol’

자연과학| 2022.06.30| 6페이지| 1,000원| 조회(457)

DMSO, MTT assay, 세포 독성 시험

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