실험기구 세척과 멸균 및 기본조작실험일시 :제출일 :전공 :학번 :실험자 :1. 이론 및 원리1) 미생물학의 정의미생물학은 눈에 보이지 않는 생명체의 세계 즉, 미생물을 공부하는 것이다. 미생물은 크기가 너무 작아 눈으로 명확하게 관찰 할 수 없기 때문에 광학현미경이나 전자현미경을 통해서만 관찰되는 생물군이다. 대략 지름이 1㎜이하의 생물체를 말하며 크기로 기준을 잡았기 때문에 분류학적으로 매우 다양하고 광범위한 생물군으로 구성되어 있으며, 세균과 원핵생물인 archaea, 균류, 원생동물, 조류, 기생동물, 바이러스 등을 포함한다. 미생물은 핵이 핵막에 둘러 싸여 있는 진핵생물(eukaryores)과 핵물질이 세포 전체에 펼쳐진 상태인 원핵생물(prokaryotes)로 구성되어 있으며, 예외적으로 바이러스(virus)는 세포를 가지지 않고 다만 유전물질인 DNA나 RNA중 하나가 단백질 외피에 싸여있다.1)2) 실험실 안전관리미생물 실험은 일반적인 실험과는 매우 다르다. 미생물 실험은 대부분 살아 있는 생명체를 취급할 뿐만 아니라, 어떤 미생물은 실험실에서의 잘못된 취급으로 인하여 감염을 유발, 본인뿐만 아니라 주위 사람들을 감염시켜 위험을 초래할 수 있다. 따라서 부주의나 사고에 의한 감염을 예방하기 위하여 항상 주의를 기울여야 한다. 특히 우리가 취급하는 미생물이 병원성균 또는 잠재적인 병원성 균이라고 생각하고 취급하는 것이 안전을 보장하는데 더욱 좋다.미생물학 실험에 임하는 학생은 미생물에 의한 감염 및 오염을 항상 염두에 두고 안전한 실험을 위하여 다음 사항을 준수하여야 한다.2)(1) 실험실에서는 지도 교수나 조교의 지시를 받고, 시작 전에 실험 내용을 반드시 읽어본다.(2) 실험실에 입실 할 때는 실험복을 착용하고 기타 소지품은 다른 장소에 보관한다. 특히 실험대 위에는 실험 도구 등 실험에 직접 필요한 것 외에 어떤 것도 올려놓아서는 안 된다.(3) 실험 중 돌발 사고에 대비하여 소화기 및 소독제, 세척제 등의 위치 및 사용 방법을 알 아 둔다. 기타 실험실에서 사용하는 도구나 기구를 허락 없이 외부로 반출해서는 안 된다.(8) 실험에 사용된 미생물이나 재료는 고압 증기 멸균 처리하여 폐기하고, 유기용매 및 독극 물은 별도 폐기 처분한다.(9) 실험이 끝난 후에는 설비, 기구 및 시약 등을 원상태로 정리하여야 한다.1)3-1) pipette- 일정 체적의 액체 또는 기체를 측정하거나 다른 용기에 추가할 수 있는 기구를 말한다.- 실험에서는 주로 마이크로피펫(micropipettes)를 사용한다.- 피펫의 종류: 홀피펫(전용피펫), 메스피펫(모어피펫, 몰피펫), 파스퇴르 피펫, 구입피펫 3)3-2) micropipette- 미량분석에서 이용되는 미량 액체의 부피를 가장 정확하게 채취 또는 배출시키기 위한유리제 용적계의 일종- 일반 피펫과의 차이: 일반 피펫은 눈금을 보며 액체를 취하지만 마이크로피펫은 먼저눈금으로 취할 부피의 양을 측정한다.- 마이크로피펫의 단위: ul(microliter)1L=1,000ml=1,000,000ul실험실에서는 ul을 람다라고 부르기도 한다.- 마이크로피펫에서 빨간 숫자와 검은 숫자로 표기되어 있는데 빨간 숫자는 천단위 혹은 소수점 아래의 자리를 의미한다.ex) 010 = 1,000ul 010 = 0.1ul- 마이크로피펫은 일회용 팁을 이용해서 원하는 만큼의 부피를 취한다.*micropipette tips: 화이트팁 (제일 작은 사이즈의 팁, 투명한 색, 10ul까지 사용가능)옐로우팁 (중간 사이즈의 팁, 노란색, 200ul까지 사용가능)블루팁 (큰 사이즈의 팁, 파란색, 1,000ul까지 사용가능)*tip을 끼우는 방법: 한손으로 마이크로피펫을 들고 다른 한손으로 팁통 (전용 랙)을 잡고,팁을 꽂아서 살짝 돌려준다. (다른 팁들의 손 접촉으로 인한 오염 최 소화, 팁 단단하게 고정시키기 위해 살짝 돌려준다.)*사용한 팁을 제거하는 방법: 피펫의 ejector부분을 누른다. (주의사항: 사용한 팁은 만지지 않는다. ? 팁에 남아있는 액체가 위험할 수 있기 때문) (동일한 액다가 피펫 안으로 들어갈 수 있고 원하는 양을 따지 못할 수 있기 때문)5. 피펫을 기울이지 않고 평면과 수직으로 한 후 액체를 딴다.6. 피펫의 부피 범위에 맞게 사용한다.3)4) Autoclave- 고온, 고압 하에 합성, 분해, 승화, 추출 등의 화학처리를 하는 내열, 내압성 용기- 대개 용기 내의 온도는 150~1600’C이고 기압은 250~1200atm이다.- 교반진동장치, 그 밖의 회전장치를 수반하는 것도 있다.- 반응에 의한 온도, 압력의 변화, 가스누출에 의한 폭발, 안전밸브, 압력계, 기밀성 등의각별한 주의가 필요하다.- Autoclave의 원리1. 물의 끓는 점은 100’C이고 그 이상으로는 온도가 높아지지 않기에 압력을 대기압보다 높게 하여 물의 온도를 원하는 만큼 올린다.2. 물이 끓으면서 발생하는 증기를 솥 안에 가둬서 압력을 높인다.- 대략 121’C, 1.2기압의 상태에서 진행한다.(121’C에서는 거의 모든 균이 멸균된다고 보기 때문이다.)⁴)5) UV cleanbench- 물리적으로 격리한 상자형의 구조내에 공기의 수직층류를 형성하여 극력미진입자들을여과할 수 있는 필터로 미립자나 균을 제거한 환경에서 미생물, 유전자 DNA 등이 밖으로 흩어지지 않게 조작할 수 있도록 고안된 기기- 내부에는 살균등, 조명등 및 가스버너가 장착된 상태이다.- 위험도가 높은 병원체를 다룰 경우, 병원체가 비산하는 것을 막기 위해서도 사용된다.- 무균 작업 실험대 (sterile air hood)라고도 한다.- HEPA(high efficiency particulate air) filter를 통해 계속적으로 공기가 나오는 형태이며, 이로 인해 열려 있는 공간에서 균이 들어오지 못하고 필터링된 공기만 계속적으로 나온다.?)6) 화염멸균백금이나 백금선 또는 시험관이나 플라스크의 입구 부위에 불꽃(화염)을 접촉시켜 그 부위의 미생물을 사멸시키는 것을 화염멸균이라 한다. 미생물 배지에서 다른 배지로 이식 접종하거나 도말할 때 사용하는 백금선이나 백금이는 보통 문에 이에 대비하여 내염에서부터 접촉시킨 후 천천히 외염으로 진행하면서 멸균한다.시험관이나 플라스크의 입구 주변의 균은 솜 마개를 뽑은 직후와 솜 마개를 막기 직전에 입구 주변을 가볍게 외염에 통과시켜 멸균하여야 한다. 이때 입구를 갑자기 가열하면 유리가 깨어질수 있으므로 천천히 가열하면서 진행하고 파손에 주의한다.⁴)2. 실습 목표-본격적인 미생물 실험에 앞서 실험실에서 기구를 조작하고, 안전한 실험을 수행하기 위해 알아야할 기본적인 내용을 습득한다.3. 실습 방법1) 재료 및 실습기구-실습기구: micropipette, micropipette tip, 알코올 램프, 핀셋, 70% 에탄올, waste 통, cleanbench, autoclave, 멸균표시 테이프2) 실습 과정(1) micropipette 사용 시에는 autoclave된 깨끗한 tip을 사용하며, 오염되지 않도록 주의한 다.(2) micropipette이 180˚ 이상으로 눕혀지지 않도록 주의한다.(3) micropipette의 tip이 용액에 충분히 잠긴 상태에서 용액을 취하고, 내보내야 한다.(4) micropipette의 tip을 꽂을 때에는 너무 세게 내려치지 않는다.(5) micropipette을 사용하고 나서는 킴테크에 알코올을 묻혀 tip을 꽂는 부분과 주변부를 닦아준다.1. micropipette 사용방법(1) 준비: micropipette을 수직으로 잡고 첫 번째 정지지점까지 plunger button을 천천히 누른다.(2) 흡입: Tip을 액체에 담그고 원래의 위치까지 천천히 plunger button을 놓아준다. 모든 액체가 tip으로 충분히 올라올 수 있도록 1초 정도 기다린다.(3) 분배: Tip을 분배할 용기의 안쪽 벽면에 10~45 정도 기울여서 plunger button을 최초 정지지점까지 눌러서 액체를 분배한다.(4) Purge(*마지막 방울까지 내보냄): 1초 정도 기다린 후에 plunger button을 두 번째 정 지지점까지 눌러서 tip에 남아있는 한 방울.(3) autoclave의 뚜껑을 꽉 잠근다.(뚜껑을 끝까지 돌려 꽉 잠그고, 잠근 방향의 반대 방향으 로 살짝만 열어준다.)(4) 시작 버튼을 눌러 121에서 20분간 고압 멸균 해준다.(5) autoclave가 끝나고 테이프 색이 진하게 변했는지 확인한다.2) cleanbench 사용방법-cleanbench는 무균 작업대로 공기중의 오염을 방지하기 위해 사용(1) UV등 버튼을 꺼주고, air버튼과, 형광등 버튼을 켜준다.(2) 앞 유리판을 손이 들어갈 정도로만 열어준 뒤, 알코올로 손을 소독한 다음 손을 cleanbench 안에 넣어서 사용한다.3) 화염멸균 방법-화염멸균은 실험 시 사용하게 될 기구들의 멸균을 하기 위함이다.(1) 핀셋을 사용할 때는 알코올 램프에 불을 붙이고 핀셋을 불로 화염멸균하여 사용한다.(2) 화염멸균한 핀셋을 실험에 사용하고 나서는 알코올 램프로 다시 화염멸균한 뒤 에탄올이 담긴 통에 꽂는다.4. 실습 결과표1. micropipette40020050표2. autoclave전후표3. cleanbench이용한 화염멸균5. 고찰본 실험은 본격적인 미생물 실험에 앞서 실험실에서 기구를 조작하고, 안전한 실험을 수행하기 위해 알아야할 기본적인 내용을 습득하는 실험이었다. 미생물학은 눈에 보이지 않는 생명체의 세계 즉, 미생물을 공부하는 것이다. 미생물은 크기가 너무 작아 눈으로 명확하게 관찰 할 수 없기 때문에 광학현미경이나 전자현미경을 통해서만 관찰되는 생물군이다. 대략 지름이 1㎜이하의 생물체를 말하며 크기로 기준을 잡았기 때문에 분류학적으로 매우 다양하고 광범위한 생물군으로 구성되어 있으며, 세균과 원핵생물인 archaea, 균류, 원생동물, 조류, 기생동물, 바이러스 등을 포함한다. 미생물은 핵이 핵막에 둘러 싸여 있는 진핵생물(eukaryores)과 핵물질이 세포 전체에 펼쳐진 상태인 원핵생물(prokaryotes)로 구성되어 있으며, 예외적으로 바이러스(virus)는 세포를 가지지 않고 다만 유전물질인 DNA나 RNA중 하나.2)
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