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[화학생물학실험 예비레포트] Protein Quantification

실험제목:Protein Quantification실험 조:실험 일자:실험 목적:다양한 단백질 정량법에 대해 이해하고 Bradford Assay를 이용해 단백질 정량을 수행한다.시약 및 기구:1. 시약1) BSA (Bovine Serum Albumin): 단백질 정량에서 정확한 표준 곡선을 그리기 위해 표준물질로써 사용한다.2) Bradford Solution 5x2. 기구: Test tube, pipette, vortex, nanodrop.실험 이론:1. 단백질 정량 (Protein Quantification): 단백질 정량은 시료 내 포함된 단백질의 양이나 농도를 구하는 과정이다. Bioengineering의 경우 결과를 확인하기 전까지 잘못된 부분을 알기 어렵기 때문에 준비 단계에서의 정확한 단백질 정량이 매우 중요하다. 또한 대부분의 실험에서 반복적으로 사용하므로 정확성도 중요하지만 간편성도 중요하다. 실험에 따라 다양한 정량법이 사용되는데, 크게 Colorimetric 법과 Electrophoresis 법으로 나누어지며 주로 colorimetric 법을 사용한다.1) 분광학적 방법: 단백질에 일정하게 포함된 페닐알라닌(Phe), 티로신(Tyr), 트립토판(Trp)의 잔기들은 280 nm 부근에서 최대 흡광도를 가진다는 점을 이용한 방법. 순수 단백질의 농도가 1 mg/mL이고, 큐벳이 1 cm일 때, 1.0의 흡광도를 가진다.장점: 빠르다, 다른 시약이 필요 없다, 시료를 그대로 회수해 사용할 수 있다.단점: 280 nm에서 높은 흡광도를 지니는 자연계 화합물 다수 존재, 핵산과 섞인 경우 260 nm에서의 흡광도를 측정 후 보정해야 함.2) 뷰렛 (Biuret) 방법: 알칼리성 CuSO4와 반응해 보라색 착화합물을 형성하는 Biuret은 CuSO4와 비슷한 구조를 가진 화합물과도 유사한 착화합물을 형성한다. 단백질의 경우에도 Cu2+ 이온이 단백질의 peptide nitrogen에 결합해 보라색 착화합물을 형성하고 540~560 nm 영역에서 흡광을 나타낸다. 착화합물의 양은 단백질 농도에 따라 달라지므로 이를 이용해 standard curve를 생성해 시료의 단백질 양을 측정할 수 있다.장점: 모든 단백질에 대해 높은 재현성, 빠르다.단점: 낮은 정확성, 착화합물은 시간이 경과하면 색도가 변색.3) Lowry 방법: 단백질 사슬의 Cu2+ 이온이 peptide bond에 결합하는 Biuret method에 기초를 두며 아미노산에서 Cu2+ 이온의 아마이드 결합으로 환원(+1)되는 정도를 측정하는 방법. Folin-Ciocalteu 시약이 단백질의 티로신과 트립토판들에 의해 환원되는 과정에서 나타나는 착색 정도를 통해 단백질 농도를 측정할 수 있다.장점: 높은 감도(비교적 정확), 5 ug/uL의 낮은 농도까지 측정 가능.단점: 단백질에 따른 변이 정도 존재, 준비 과정이나 시약이 복잡해 오래 걸림, 방해 물질 존재 시 사용 불가.[과정]① Biuret Reaction: 알칼리 용액에서 Cu2+와 protein peptide bond 간에 complex를 형성시켜서 Cu2+가 Cu+로 환원된다.② Folin-Ciocalteu Reaction: Cu+와 트립토판, 티로신의 radical group이 Folin-Ciocalteu reagent (phosphomolybdate and phosphotungstate complex (노란색)를 환원시켜서 진한 청색으로 변한다. (yellow deep blue)4) Bradford 방법: Coomassie Brilliant Blue G-250이라는 dye가 단백질과 결합 시 최대 흡광도가 465 nm (red)에서 595 nm (blue)로 이동한다는 사실에 기초하여 dye가 트립토판(Trp), 티로신(Tyr), 페닐알라닌(Phe), 히스티딘(His) - hydrophobic interaction과 아르기닌(Arg), 라이신(Lys)- electrostatic attraction에 결합시의 흡광도의 변화를 측정하는 방법.장점: 빠른 발색반응, 짧은 소요시간, 비교적 높은 감도 (1-20 ug), 방해물질 거의 없음.단점: 단백질마다 dye 결합 정도 다름, 석영 큐벳과 반응하므로 유리/플라스틱 큐벳 사용해야 함, 표준검량물질 선택 중요.5) BCA (Bicinchoninic Acid) 방법: 단백질 용액에 Cu2+ 이온을 반응시킨 후, Bicinchoninate(BCA)가 트립토판(Trp), 티로신(Tyr), 시스테인(Cys)의 도움으로 Cu+ 이온과 복합체를 형성하여 자색으로 발색하는 반응을 이용한 방법.장점: 최종 시료의 높은 안정성으로 인한 넓은 온도 범위, 간단한 방법.단점: 느린 반응, 단백질 변성 가능성.주의사항:실험복과 보안경, 장갑을 반드시 착용한다.시약은 반드시 환기 상태에서 사용하고 사용 후 반드시 뚜껑을 닫는다.실험방법:BSA (2 mg/ml)로 standard curve를 만든다.각 microtube에 Bradford solution(5X)를 200 ul씩 넣어 final 1X가 되도록 한 후, 바로 vortexing 한다.5분간 반응시킨 후, 595 nm에서 흡광도를 잰다.Standard curve를 그리고, 단백질량을 계산한다.실험결과:고찰:참고문헌:

자연과학| 2022.06.09| 4페이지| 2,000원| 조회(174)

Protein, 단백질정량, 예비레포트, 결과레포트, Quantification, 화학생물학

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[일반생물학실험 결과레포트] 현미경과 파이펫(pitette)의 원리 및 사용법

2주차 - 현미경과 파이펫(pitette)의 원리 및 사용법1. Title : 현미경과 파이펫(pitette)의 원리 및 사용법2. Date :3. Name :4. Purpose : 일반생물학 실험에서 사용되는 광학현미경의 구조와 기능을 익히고 그 밖에 실험에 주로 사용되는 장비인 Pipette, Autoclave, Clean bench, 세포배양기, 원심분리기 등의 기능과 사용방법을 익혀 보도록 한다. 생물학 실험에 사용되는 용어들(부피단위, 질량단위, 농도단위 포함)에 대해서 알아본다.5. Materials광학현미경, slide glass, pipette, tip, 1.5ml microtube, 15ml tube, 설탕물, 색소6. Methods① 물체를 관찰할 수 있는 상태로 현미경을 장치한다.② 관찰대상을 이용하여 프레파라트를 만든다.③ 저배율에서 고배율로 측정해가며 대상의 크기를 관찰한다.④ 각 배율별로 초점을 맞추어보고 촬영한다.① 1명이 대표로 1ml pipette을 사용하여 증류수 400ul를 microtube(1)에 넣는다.② 다른 2명이 200ul pipette을 사용하여 microtube(2)에 200ul를 담아본다.③ 10ul pipette을 사용하여 microtube(3) 에 50ul의 증류수를 담아본다.④ 200ul pipette을 사용하여 50ul의 증류수를 다른 microtube(4)에 옮겨 담아본다.⑤ (1)과 (2), (3)과 (4)가 일치하는지 확인한다. 그렇지 않을 경우 단위를 확인하며 반복한다.① 색소가 들어있는 80%의 설탕물과 색감을 낼 시료, tube를 받고 라벨링한다.② 80%의 설탕물로 30%와 5%의 설탕물을 만들어 본다. (inverting)(A)80% 설탕물 (B)30% 설탕물 (C)5% 설탕물③ (A)는 초록색 (B)는 주황색 (C)는 파란색 의 염색약을 넣어 다시 inverting④ 1000ul(1ml) pipette으로 농도가 높은 설탕물부터 2ml씩 15ml tube에 담아 색깔 별 탑을 쌓아본다.7. Results사진세부사항좌측 : 1ml pipette을 사용하여 증류수 400ul를 담은 microtube(1)우측 : 200ul pipette을 사용하여 증류수 400ul를 담은 microtube(2)좌측 : 10ul pipette을 사용하여 증류수 50ul를 담은 microtube(3)우측 : 200ul pipette을 사용하여 증류수 50ul를 담은 microtube(4)사진설명아래쪽부터 80%의 설탕물 (초록색), 30%의 설탕물(갈색), 그리고 5%의 설탕물(보라색)이다. 좌측의 결과 사진을 통해 용액의 농도별로 밀도 차가 생겨 각 층이 분리된 것을 관찰할 수 있다.8. Discussion이번 실험에서는 현미경의 구조를 이해하고, 배율을 조정하여 자유자재로 시료를 관찰할 수 있는 현미경 사용법을 배웠다. 또한 pipette의 다이얼을 조정하는 방법을 배우고 이를 통해 농도차를 이용한 설탕물 탑 쌓기 실험을 하였다.Pipette의 사용에서는 pipette의 다이얼을 조작해 같은 양의 시료를 시험관에 넣어보았다. 같은 양의 시료를 담았지만 어떤 용량의 pipette을 사용했냐에 따라 육안으로 확인할 수 있는 시료양의 차이가 있었다. 상대적으로 저용량의 pipette보다 고용량의 pipette에서 같은 양의 시료를 계량할 때 오차범위가 더 컸을 것으로 예상된다. 오차를 줄이기 위해서는 계량하는 양에 적절한 용량의 pipette을 사용하는 것이 중요하다.Pipette을 이용한 Serial Dilution에서는 가장 농도가 진한 설탕물이 아래로, 가장 농도가 연한 설탕물이 위로 쌓였다. 이는 설탕물의 농도차에 의한 현상이다. 이 실험을 할 때 주의해야하는 사항 몇가지가 있다. 우선 농도의 차이가 너무 미세하거나 농도별 용액의 순서를 지키지 않았을 때는 실험에 실패할 확률이 커진다. 또한 용액이 시험관의 벽면을 타고 흐르도록 해야지 표면으로 pipette을 갖다대면 두 용액이 섞여 물탑을 만들 수 없게 된다.9. Projects① 현미경의 다양한 종류에 대해 조사한 후 간단하게 정리해보세요.- 현미경은 크게 광학현미경과 전자현미경 두가지로 나눠진다. 광학 현미경은 가시광선을 이용하며 굴절률 차이를 통해 상의 대비를 만들어내는 위상차현미경법, 두 편광을 통해 관찰된 이미지를 조합해 보여지는 미분간접현미경법, 빛에 의해 자극받은 형광염료의 형관을 관찰하는 형광현미경법 등이 있다. 광학현미경은 세포보다 더 작은 물질은 관찰하기 힘들다는 단점이 있는데 이 단점을 보완, 전자를 이용해 관찰할 수 있도록 만들어진 현미경이 전자현미경이다. 전자현미경의 방식으로는 시료에 조사한 전자의 투과여부 감지를 통해 이미지를 얻는 투과전자현미경법(TEM), 시료 표면에 전자를 직접 조사해 다른 전자의 방출을 감지해내는 주사전자현미경법(SEM)이 있다.

자연과학| 2022.06.09| 4페이지| 2,000원| 조회(162)

현미경, 일반생물학, 원리, 결과레포트, 파이펫

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[화학생물학실험 예비레포트 및 결과레포트] Plasmid DNA Mini Preparation

실험제목:Plasmid DNA Mini Preparation실험 조:실험 일자:실험 목적:DNA transformation을 통해 얻은 형질전환체를 수확하여 Plasmid DNA를 추출한다.시약 및 기구:1. 시약1) LB medium2) Solution 1 Buffer (Resuspension Buffer)① Tris-Cl: pH를 유지하는 역할.② EDTA [C10H16N2O8, MW 292.24 g/mol, D 0.860 g/cm3].: 킬레이트로 작용해 세포벽의 안정성을 유지하는 Ca2+을 제거, 세포벽 파괴를 돕는다.※ 눈 자극 유발. 장기간 또는 반복노출 시 신체와 수생생물에 유독. 고온에서 분해 시 자극성, 독성 가스 발생.③ RNase: RNA를 파괴해 실험 target인 플라스미드 DNA만을 얻을 수 있게 해준다.④ Glucose: 삼투압을 유지해 세포가 터지지 않도록 한다.3) Solution 2 Buffer (Lysis Buffer)① NaOH: pH를 상승시켜 gDNA denaturation을 유발, 두 가닥으로 갈라지게 한다. 갈라진 상태에서도 supercoil 상태로 가닥이 완전히 분리되지는 않기 때문에 circular DNA로 renaturation 될 수 있다.② SDS [C12H25NaSO4, MW 288.37 g/mol, D 1.01 g/cm3, MP 206 ℃]: 세포막을 분해하고 단백질을 제거한다. DNA와 RNA를 변성시켜 단백질 denaturation을 유발하며 장시간 처리시 pDNA가 renaturation되기 힘드므로 주의해야한다.※ 삼키거나 피부와 접촉 시 유해함. 화재시 자극성, 부식성, 독성 가스 발생.점화원, 가연성/환원성 물질을 피할 것. 환기가 잘 되는 곳에서 사용하고 사용 후에는 철저히 밀폐할 것.3) Solution 3 Buffer (Neutralization Buffer): 빙초산으로 적정한 아세트산 칼륨으로 높아진 pH를 중성으로 되돌려 변성된 plasmid DNA가 원형으로 돌아갈 수 있게 해준다.16.6 ℃]※ 인화성 액체 및 증기. 금속 부식 가능성. 눈, 호흡기계, 피부 자극 유발. 열, 스파크, 화염, 고열로부터 멀리해야 함. 인화성/연소성 물질.② 아세트산칼륨 (Potassium Acetate)[CH3CO2K, MW 98.15 g/mol, D 1.57 g/cm3, MP 292 ℃]: Solution 2 buffer의 SDS와 반응하여 KDS를 형성, 흰색 침전이 생긴다.※ 상온상압조건에서 안정. 흡입 시 유해. 열, 스파크, 화염 등 점화원으로부터 멀리해야 함. 가연성 물질, 자극성/독성 가스 피해야 함.4) Washing Buffer (PW) [70 % EtOH]: 에탄올 침전법을 이용, 잔여 염을 씻어내 플라스미드의 DNA Purity를 높여줌.5) Elution Buffer (DDW, 탈이온증류수): 칼럼의 membrane에 붙은 플라스미드 DNA를 떼냄.2. 기구: E-tube, centrifuge, pipette, incubator, filter column.실험 이론:1. Plasmid DNA의 추출 및 정제: Total cell DNA를 분리하는 것과 같이, 배지에서 배양하여 수확한 플라스미드를 cell extract를 통해 정제할 수 있다. 하지만 플라스미드 분리는 대개 많은 양의 chromosomal DNA로부터 분리해야하므로 플라스미드 DNA와 bacterial DNA의 물리적 차이를 이용해 정제해야한다.* Plasmid DNA: Extract 시 원형 형태 유지.* Chromosomal(Bacterial) DNA: Extract 시 선형 조각으로 깨짐.* 분리법의 종류1) Alkaline Lysis: 빠르고 안정적이면서 clean한 결과를 얻을 수 있어 가장 일반적으로 사용되는 분리 방법이다. 초나선형 플라스미드가 pH 변화에도 그 구조나 형태가 크게 변하지 않는다는 성질을 이용한다.2) Boiling Method: 플라스미드를 가진 박테리아에 열을 가하면 chromosomal DNA는 세포막에 결합된 상태로 남아 원심분리를용되는데, alkaline lysis 보다는 purity가 낮다는 단점이 있다.3) Lithium-Based Procedure: Bacterial cell을 Triton X-100/LiCl, phenol/chloroform으로 처리하면 plasmid DNA는 가용성화 되고, chromosomal DNA와 cellular debris는 침전된다. 마찬가지로 원심분리를 이용해 plasmid DNA만을 얻을 수 있으며 가장 빠른 DNA 분리법이다.2. Alkaline Lysis Mini Preparation* 과정: 가장 먼저 EDTA와 RNase가 포함된 buffer를 사용해 세포벽과 RNA를 파괴한다. 이때 buffer에는 pH와 삼투압을 유지하기 위해 각각 Tris-Cl, glucose가 들어있다. SDS를 가해 단백질을 변성시키고, NaOH를 가해 pH를 높여 DNA의 이중나선 구조를 파괴한다. 이후 아세트산 칼륨을 더해 sample을 중성화시키면 gDNA와 단백질이 침전되면서 플라스미드 DNA만을 얻을 수 있다.이후 SDS를 가해 세포막을 분해하고 단백질을 제거한다. 또한 SDS에 의해 DNA와 RNA가 변성된다. 높은 pH로 gDNA를 denaturation 시키기 위해 NaOH도 함께 가한다.마지막으로 변성된 plasmid DNA를 원형으로 되돌리기 위해 중성화가 필요하다. 빙초산으로 적정한 아세트산칼륨을 첨가해 pH를 조절하면 gDNA는 헝클어진 상태로 뭉치고 단백질과 함께 침전되어 플라스미드만 상등액에 남는다. 에탄올 침전법을 이용해 plasmid DNA의 정제와 농축이 가능하다.주의사항:실험복과 보안경, 장갑을 반드시 착용한다.시약은 반드시 환기 상태에서 사용하고 사용 후 반드시 뚜껑을 닫는다.실험방법:배양한 LB medium을 E-tube에 담는다.Centri 14000, 1min 후 상층액 버린다.S1 buffer를 250ul 넣고 resuspendS2 buffer를 250ul 넣고 mix by inverting(*DO NOT VORTEX)Inumn에 넣고 14000, 10min centri하층액 버리고 750ul Washing buffer(PW) 넣고 다시 centri 14000, 1 min하층액 버리고 다시 centri 14000, 1 min아래 부분에 새로운 E-tube 넣은 후, 50ul EB buffer 넣고 centri 14000, 1 min -> Elution한다.실험결과:Nucleic Acid Conc.UnitA260nmA280nm260/280260/230DNA429.5ng/µl8.5904.5241.902.17고찰:이번 실험에서는 지난 시간 transformation 실험을 통해 배지에서 배양한 ampicillin 저항성 박테리아를 수확, 증폭시켜둔 DNA 샘플을 가지고 DNA preparation을 진행하였다. 플라스미드 DNA만을 분리해내기 위해 alkaline lysis method를 사용하였으며 우선 준비된 샘플에 S1 250 ul를 가해 resuspension 하였다. 이 과정에서 EDTA와 RNase에 의해 세포벽 및 RNA를 파괴해 다음 과정인 lysis가 일어나기 쉬운 환경을 만들어 주었다. S2 350 ul를 가해 pH를 높여 chromosomal DNA의 이중가닥 구조를 linear한 두 가닥으로 갈라지게 해 denaturation을 유발한다. 이때 chromosomal DNA는 supercoiled 상태가 되어 다음 단계인 neutralization에서 neutralize되지 못하게 된다. 반면 플라스미드 DNA는 pH 변화에도 그 구조가 원형으로 유지된다. 마지막으로 pH를 다시 원래대로 되돌려주는 S3 350 ul를 가해 neutralization을 진행하여 얻은 최종 샘플의 순도를 측정한 결과는 위와 같다.핵산 농도는 429.5 ng/µl였으며 260/280과 260/230 값은 각각 1.90, 2.17이었다. 260/280이 1.8 미만일 때 DNA가 ‘순수’하다고 여겨질 수 있기 때문에 본 결과값을 통해 이 실험에서 추출된 DNA는 불순물이 다소 제거되지 NA를 추출할 때 membrane에서 salt가 잘 제거된 것으로 보인다.Mouse tail의 gDNA isolation을 통해 얻은 샘플 DNA 1, 2는 각각 1.81, 1.92의 260/280 값을 가졌다. 이를 통해 순도에서 의미있는 발전은 없었다고 볼 수 있다. 더 순수한 DNA를 분리해내기 위해서는 preparation의 각 과정에서 모든 solution이 적절히 작용할 수 있도록 충분한 반응 시간의 조절이 필요하다. 또한 centrifuge나 column membrane을 사용했을 때 샘플의 loss가 일어나지 않도록 주의해야 한다.Chromosomal DNA는 모든 동물들이 가지고 있는 DNA이지만, 플라스미드 DNA는 박테리아만 가지고 있는 DNA로 그 형태가 circular하고 외부 환경에 영향을 거의 받지 않는다. 벡터를 이용한 형질 전환 등의 조작이 가능한 플라스미드 DNA는 유전공학에서 매우 중요한 역할을 하기 때문에 chromosomal DNA로부터의 분리 또한 매우 중요하다.참고문헌: Hyperlink "http://msds.kosha.or.kr/MSDSInfo/kcic/msdsdetail.do" http://msds.kosha.or.kr/MSDSInfo/kcic/msdsdetail.do (안전보건공단 화학물질정보, 안전보건공단, 방문일: 2021. 10. 23.) Hyperlink "https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5894586&cid=61232&categoryId=61232" https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5894586&cid=61232&categoryId=61232 (한국미생물학회, 미생물학백과, 네이버 지식백과, 방문일: 2021. 10. 23.) Hyperlink "https://askabiologist.asu.edu/alkaline-lysis" https://askabiologist.asu.edu/alkaline-lysis (Ask A )

자연과학| 2022.06.09| 6페이지| 3,000원| 조회(290)

예비레포트, 결과레포트, Plasmid DNA, mini preparation, 화학생물학

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[화학생물학실험 예비레포트 및 결과레포트] Genomic DNA isolation from mouse tail (Tail Lysis)

실험제목:Genomic DNA isolation from mouse tail실험 조:실험 일자:실험 목적:세포로부터의 DNA 추출 과정과 사용되는 시약의 역할을 이해하고 DNA를 직접 추출해본다.시약 및 기구:시약1) Proteinase K: 광범위 스펙트럼의 세린 단백분해효소로 Keratin을 분해할 수 있다. pH 8.0에서 가장 안정적이며 염색체에서 DNA를 감싸고 있는 히스톤 단백질을 용해하여 높은 순도의 gDNA 추출을 돕고, 다양한 단백질의 활성을 억제하는 역할을 한다.2) Tail lysis buffer① 0.1 M Tris-HCl pH 8.0[C4H11NO3, MW 121.14 g/mol, D 1.33 g/cm3, BP 219 ℃, MP 175 ℃].※ 피부, 눈, 호흡기계 자극 유발.※ 점화원, 가연성/환원성 물질을 피할 것.※ 환기가 잘 되는 곳에서 사용하고 사용 후에는 철저히 밀폐할 것.② 0.2 M NaCl [MW 58.4 g/mol, D 2.17 g/cm3, BP 1465 ℃, MP 800 ℃]③ 5 mM EDTA[C10H16N2O8, MW 292.24 g/mol, D 0.860 g/cm3].※ 눈 자극 유발.※ 장기간 또는 반복노출 시 신체와 수생생물에 유독.※ 고온에서 분해 시 자극성, 독성 가스 발생.④ 0.2 % SDS[C12H25NaSO4, MW 288.37 g/mol, D 1.01 g/cm3, MP 206 ℃]※ 삼키거나 피부와 접촉 시 유해함.※ 화재시 자극성, 부식성, 독성 가스 발생.※ 점화원, 가연성/환원성 물질을 피할 것.※ 환기가 잘 되는 곳에서 사용하고 사용 후에는 철저히 밀폐할 것.3) Isopropanol[C2H6O, MW 60.10 g/mol, D 0.786 g/cm3, BP 82.6 ℃, MP -89 ℃]※ 인화성 액체 및 증기.※ 눈, 호흡기계 자극 유발.※ 점화원, 가연성/환원성 물질을 피할 것.4) Ethanol[C3H8O, MW 46.07 g/mol, D 0.789 g/cm3, BP 78.4 ℃, M충하기 위해 사용된다.② NaCl: DNA와 단백질의 분리와 단백질들이 DNA와 함께 알코올에 침전되지 않도록 돕는다.③ EDTA: 킬레이트 화합물을 형성하는 금속 이온과의 강한 친화력으로 효소가 필요로 하는 금속 이온을 제거하여 효소의 생성을 억제함으로써 시료의 손상을 방지한다.④ SDS: 단백질의 완전한 용해를 돕는 물질로 단백질을 선형화하여 음전하를 전달, 단백질을 변성시킨다.Ethanol Precipitation (에탄올 침전법): DNA가 침전되기 위해서는 용액에서의 DNA 용해도를 낮춰야한다. 에탄올은 -OH기의 극성이 DNA 염기 사이에 존재하는 수소 결합을 방해하고, 물과 DNA의 상호작용에서 물이 DNA 대신 친화도가 더 높은 에탄올과 결합함으로써 DNA를 침전시킨다. 사용한 buffer에 존재하는 salt는 DNA의 Phosphate기를 봉쇄, DNA를 중화시켜 친수성을 떨어뜨린다.1) DNA의 용해도는 isopropanol에서 더 낮기 때문에 비교적 적은 양으로도 DNA를 침전시킬 수 있다. 시료의 양이 많거나 DNA의 농도가 낮을 때 isopropanol을 사용하면 보다 효과적이다.2) Salt의 용해도는 isopropanol에서 더 낮기 때문에 salt가 DNA와 더 잘 침전된다. 때문에 isopropanol로 보다 큰 DNA pellet을 얻을 수 있는데, 이는 DNA 침전 효율이 높은 것도 있지만 salt가 DNA와 함께 더 많이 침전되는 영향도 있다.3) 용매의 휘발성은 ethanol이 더 높기 때문에 용매 제거에서는 ethanol이 유리하다.∴ 시료의 물성과 실험 과정에 적합한 시약을 적절히 선택, 사용하여야 한다.주의사항:실험복과 보안경, 장갑을 반드시 착용한다.시약은 반드시 환기 상태에서 사용하고 사용 후 반드시 뚜껑을 닫는다.원심분리기 사용법을 숙지하고 따른다.실험방법:Add proteinase K to lysis buffer, use 500 µl lysis buffer per tailIncubate overnight at 1:1 volume of iso-propanol for precipitate DNAMix well by inverting (※ Do not vortex)Centrifuge samples at 14,000 rpm, 10 min for spin down DNA pelletDiscard supernatantAdd 1:1 volume of 70% ethanol for washingCentrifuge samples at 14,000 rpm, 10 min for spin down DNA pelletDiscard supernatantAdd TE buffer 150~200 ul for elute DNA pelletAfter 24 hours, measure the DNA concentration.실험결과:Nucleic Acid Conc.UnitA260nmA280nm260/280260/230DNA 112.9ng/µl0.2590.1431.811.89DNA 2240.6ng/µl1.6730.8691.922.18좌: Phenol Chloroform을 넣은 직후 (실험방법 5), 우: 실험이 끝난 Test Tube의 모습고찰:1. SDS, EDTA의 역할: SDS는 anionic detergent로 작용하여 2차 단백질 구조와 비황화결합 3차 단백질 구조를 선형으로 펼침으로써 단백질의 원형 구조를 파괴, 결과적으로 단백질을 변성시킨다.DNase가 작용하기 위해서는 금속 이온이 필요한데 EDTA는 DNase보다 뛰어난 금속 이온과의 친화력으로 용액 내 존재하는 금속 이온과 강하게 결합한다. 따라서 DNase는 작용되지 못하게 됨으로써 DNA의 손상을 막을 수 있다.2. Phenol chloroform의 역할: 다양한 아미노산의 사슬로 이루어진 단백질은 극성기와 비극성기를 모두 가지고 있으며 단백질의 2,3,4차 구조는 아미노산의 극성에 의존한다. 비극성 용액인 페놀을 첨가함으로써 아미노산 사이의 결합이 영향을 받고 결과적으로 단백질 변성을 야기할 수 있다. 즉 페놀은 단백질 구조를 펼쳐 기 때문에 이를 제거하고 용매를 더 빨리 휘발시키기 위해 에탄올로 한 번 더 washing해주는 것이 효율적일 수 있다.4. DNA 농도 측정 시 260/280, 260/230 ratio의 의미: 260/280 파장 영역 260 nm와 280 nm에서의 흡광도 비율을 나타낸다. 이 비율은 DNA의 순도를 정량화하는 것으로 일반적으로 1.8 미만일 때 추출된 DNA가 ‘순수’하다고 여겨진다. 260/230은 파장 영역 260 nm와 230 nm에서의 흡광도 비율을 나타내는데, 원치 않는 salt의 오염도를 나타낸다. 일반적으로 2.0~2.2의 범위에 포함되어야 적합하다고 본다.이 실험에서는 쥐의 꼬리를 직접 채취하여 구비된 lysis buffer와 proteinase K를 첨가하여 DNA 정제, 농축, 추출 과정을 실험하였다.DNA 1은 260/280, 260/230 ratio가 각각 1.81, 1.89로 나타났다. 따라서 순도는 기준 수치인 1.8에 근사하기 때문에 순수한 DNA를 추출했다고 볼 수 있을 것이며, salt 오염도는 비교적 높다.DNA 2은 260/280, 260/230 ratio가 각각 1.92, 2.18로 나타났다. 따라서 순도는 기준 수치인 1.8보다 다소 높기 때문에 순수한 DNA를 추출하지 못했다고 볼 수 있을 것이며, salt 오염도는 비교적 낮다.Salt의 오염도를 낮춰 260/230 ratio를 향상시키는 방법으로는 아세트산나트륨과 에탄올과 같은 시료를 이용해 재침전시키는 방법이 있다. 침전물이나 덩어리는 아세트산나트륨으로 최대한 녹인 후 에탄올로 washing하여 salt를 최대한 제거한 후 다시 흡광도를 측정해보는 시도가 필요할 것이다.같은 조건에서 실험을 했음에도 두 시료의 순도에서 비교적 차이가 발생하였다. 이는 실험 도중 한 test tube의 tail lysed solution의 loss가 일어난 것이 원인이 되었을 것으로 추측할 수 있다. 또한 incubation이 적절히 진행되지 않았을 경우에도 이와 같은 순도가 나타xtraction-basics-preparation-of-chemicals-and-protocol/" https://geneticeducation.co.in/phenol-chloroform-dna-extraction-basics-preparation-of-chemicals-and-protocol/ (방문일: 2021. 09. 15.) Hyperlink "https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/T123-NanoDrop-Lite-Interpretation-of-Nucleic-Acid-260-280-Ratios.pdf" https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/T123-NanoDrop-Lite-Interpretation-of-Nucleic-Acid-260-280-Ratios.pdf (방문일: 2021. 09. 15.) Hyperlink "https://terms.naver.com/entry.naver?docId=1134927&cid=40942&categoryId=32273" https://terms.naver.com/entry.naver?docId=1134927&cid=40942&categoryId=32273 (두산백과, 네이버 지식백과, 방문일: 2021. 09. 15.) Hyperlink "https://terms.naver.com/entry.naver?docId=1134434&cid=40942&categoryId=32277" https://terms.naver.com/entry.naver?docId=1134434&cid=40942&categoryId=32277 (두산백과, 네이버 지식백과, 방문일: 2021. 09. 15.) Hyperlink "https://terms.naver.com/entry.naver?docId=1125541&cid=40942&categoryId=32273" https://terms.naver.com/entry.naver?docI2019

자연과학| 2022.06.09| 6페이지| 3,000원| 조회(516)

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[화학생물학실험 예비레포트 및 결과레포트] 형질전환 (Transformation)

실험제목:형질전환 (Transformation)실험 조:실험 일자:실험 목적:형질전환의 기작을 이해하고 실험을 통해 과정을 확인한다.시약 및 기구:1. 시약: Competent cell, DNA, LB medium.2. 기구: Ice, test tube, pipette, water bath, LB agar plate.실험 이론:1. 형질전환 (Transformation): 외부의 DNA 분자에 의해 세포에 유전적인 변화가 일어나는 것, 즉 외부 DNA가 세균에 유입되는 과정을 뜻한다. 1928년 그리피스의 폐렴쌍구균을 이용해 DNA가 병원성 전달의 원인임을 규명한 실험을 통해 발견되었고 동물 및 식물의 형질전환은 GMO를 만드는 기술 등으로 이용되고 있다.동물 세포에서의 형질전환은 종양세포와 유사한 형질로 증식능력이 변화하는 것을 뜻하기 때문에 동물세포로의 DNA 도입은 ‘transfection’이라 한다. 이론적으로 모든 종류의 박테리아는 배양 배지로부터 DNA를 주입하는 것이 가능하다.* Transformation vs Transfection2. 형질전환 가능세포 (Competent Cell): 외부의 DNA를 잘 받아들일 수 있도록 정상 세균 세포에 물리∙화학적 처리를 통해 효과적인 형질전환을 위해 만든 세포이다. 보통 세포벽에 CaCl2를 처리, 이것이 cation으로 작용하여 membrane lipid와 결합하면 lipid가 조각나고, heat shock을 통해 membrane이 열릴 수 있게 된다.자연적 형질전환에서는 DNA 조각이 세균을 흡수한 후 host cell이 DNA를 받는다. 단일 DNA 가닥이 host cell의 상보적인 부분에 들어감으로써 안정적인 형질전환이 가능하지만 분해가 일어나면 형질전환에 실패한다.DNA 플라스미드는 세균을 흡수한 이후 세포가 분열하더라도 복제원점이 있기 때문에 자연적인 형질전환과 달리 흡수되기만 하면 안정적인 유지와 유전자 발현이 가능하다.3. 플라스미드 (Plasmid): 염색체 DNA에서 물리적으로 분리된 에피솜(episome) DNA 분자로, 작은 원형의 형태로 염색체보다 적은 유전자를 가짐. 박테리아 간 접합이 일어나는 동안 세포 간 이동이 가능하기 때문에 외부 DNA의 전달을 도울 수 있다. 따라서 유전자 재조합에 유용하게 사용된다.1) 분류① 저항성 플라스미드 (Resistance Plasmids): 항생제 같은 생장 저해물질에 대해 내성을 갖는 플라스미드로 형질전환, 형질도입, 접합에 의해 다른 세균으로 수평적 전달이 가능하다.② 생식성 플라스미드 (Fertility Plasmids): 세균 접합에 필요한 유전자를 암호화하는 동시에 IS 서열을 갖기 때문에 숙주 염색체로 삽입될 수 있다. 따라서 다른 세균으로 염색체 상의 유전자 전달이 가능하다.③ 분해성 플라스미드 (Metabolics Plasmids): 자연에서 어렵게 발견되는 유기화합물의 분해가 가능한 유전자를 가진 플라스미드.④ 병원성 플라스미드 (Virulence Plasmids): 독소를 생산하는 유전자를 암호화하는 플라스미드. 숙주에서 집락화하고 감염되어 피해를 준다.4. Cloning Vector: 외부 DNA 단편을 숙주 내 삽입하기 위해 사용하는 vector로, 숙주 내에서 안정적으로 유지된다. Plasmid가 대표적인 예시로 보통 복제 원점, 다중 클로닝 부위, 선택표지자 등을 가지고 있다. (5주차 예비레포트 참고)* 필수 요소① 복제 원점 (Origin of Replication)② 다중 클로닝 부위 (Multi-Cloning Sites, MCS): 외부 DNA를 집어넣는 데 유용한 다수의 제한효소 절단 염기서열 포함.③ 선택표지자 (Selective Marker)④ 프로모터 서열, 리보솜 결합부 등5. Selection Marker: Competent cell의 낮은 효율(0.01 %)에도 불구하고 형질전환체가 선별될 수 있도록 해주는 역할을 한다. Ampicillin에 저항성을 갖는 유전자를 박테리아에 넣어주면 플라스미드는 ampicillin resistance protein을 생성하게 된다. 이 selection marker를 통해 형질전환이 제대로 이뤄졌다면, ampicililin이 포함된 배지에서도 박테리아의 cloning이 가능하고 이를 colony를 톻해 확인할 수 있다.주의사항:실험복과 보안경, 장갑을 반드시 착용한다.시약은 반드시 환기 상태에서 사용하고 사용 후 반드시 뚜껑을 닫는다.Selection marker에 신체가 노출되지 않도록 주의한다.Competent cell은 반드시 ice에서 천천히 녹인다.LB 배지에 competent cell을 도말할 때 배지가 찢어지지 않도록 주의한다.실험방법:Competent cell르 ice에서 녹인다.DNA 1ul을 넣고 약하게 tappingIce에 꽂고 30min42℃에서 1min ~ 1min 30sec 동안 Heat ShockLB medium 800ul 첨가37℃ 40min in shakerLB agar plate에 도말37℃ Incubation (12hr)Colony 확인실험결과:Incubation한 결과, 배지의 절반에 해당하는 구역에서 8개의 colony만이 나타났다.고찰:1. Cloning을 하기 위한 vector에 필수적인 요소 4가지와 각각의 역할을 서술하시오.: 복제원점은 복제가 시작되는 지점으로 이곳을 기점으로 양방향 복제가 시작된다. Multi cloning site는 DNA가 들어갈 수 있게 하는데 유용한 제한효소 절단 염기서열을 포함하고 있다. Selection marker는 플라스미드가 특정 물질에 내성을 갖게 하여 박테리아 배양 후 transformation된 박테리아만을 selection할 수 있게 해준다. Promoter는 전사 시작을 위해 결합하는 DNA의 특점 염기서열 부위로, 플라스미드에 promoter가 없으면 복제 시작을 할 수 없다.2. 형질전환 시에 bacteria를 이용하는 이유 3가지에 대하여 설명하시오.: 이론적으로 모든 종류의 박테리아는 배양 배지로부터 DNA를 주입하는 것이 가능하고, 대량으로 배양하기 쉽기 때문에 host cell로 흔히 사용된다. (빠른 doubling) 특히 E. coli는 높은 수준의 단백질 발현 능력을 가지고 있고 성장 조건이 까다롭지 않아 선호된다.3. Transformation시에 쓰는 Competence cell을 만들 때, E. coli를 CaCl2 용액에서 incubation 시키는 데, 이 용액의 역할에 대하여 서술하시오.: CaCl2는 cation으로써 E. coli의 세포벽을 이루는 lipid와 같은 구성물질의 음전하를 띠는 phosphate와 complex를 이룬다. 따라서 세포벽의 구조가 파괴되어 플라스미드의 삽입이 용이해진다.이번 실험에서는 competent cell과 ampicillin-resistance selection marker를 통해 transformation 된 박테리아의 cloning을 배지에서 확인하였다. 준비된 competent cell을 ice에서 천천히 녹인 후 1μL의 DNA를 넣어 약하게 tapping 하였다. Ice에서 10분 정도 stabilization 후, 42 ℃에서 40초간 heat shock을 주었다. 다시 ice에서 LB medium을 250 μL 가하고 37 ℃에서 incubation 하였다. (이때 competent cell은 매우 연약한 상태로, medium에 ampicillin이 포함되어 있으면 ampicillin이 세포벽을 공격해 형질전환체까지 파괴되므로 주의한다.) 이 sample을 ampicillin이 포함된 배지에 도말하여 12~16 시간동안 배양한 결과 그림 1과 같은 colony가 나타났다.실험의 목표는 ampicillin에 내성을 가진 형질전환 세포를 복제하는 것이었다. 우리는ampicillin이 포함된 LB agar에서의 colony 형성을 통해 competent cell가 ampicillin-resistance cell로 형질전환됐음을 확인할 수 있었다. LB agar에서의 배양을 통해 형질전환체의 선별(selection)이 가능한 것이다.다만 같은 조건으로 실험을 진행한 다른 배양 배지들보다 비교적 적은 수의 colony가 관찰되었다. 그 이유를 배지에 sample 도말 시 spreader에 충분한 양의 sample을 묻히지 못했기 때문이라 예상하였다. 혹은 test tube 내에서 sample이 균일하게 섞이지 않았을 수도 있다. 더 많은 colony를 얻고 싶다면 위 과정을 보완하고, 과정 전반에서 프로토콜과 같이 충분한 시간을 가지는 것도 도움이 될 것이다.Cloning vector를 이용한 transformation은 다양한 유전자 삽입을 통해 여러 형질을 가진 박테리아의 인위적 생성을 가능하게 해준다. Transformation을 통해 생성된 형질전환체를 증폭시킨 후 원하는 DNA를 추출할 수도 있는데, 결론적으로 target DNA를 최고효율로 복제하기 위해 이런 과정을 거친다고 볼 수 있다.참고문헌: Hyperlink "https://terms.naver.com/entry.naver?docId=1163380&cid=40942&categoryId=32326" https://terms.naver.com/entry.naver?docId=1163380&cid=40942&categoryId=32326 (두산백과, 네이버 지식백과, 방문일: 2021. 10. 14.) Hyperlink "https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5144996&cid=61232&categoryId=61232" https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5144996&cid=61232&categoryId=61232 (한국미생물학회, 미생물학백과, 네이버 지식백과, 방문일: 2021. 10. 14.)

자연과학| 2022.06.09| 5페이지| 3,000원| 조회(295)

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