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서강대학교 현생실4_미생물 DNA의 추출과 NGS를 이용한 Microbiome 분석

미생물 DNA의 추출과 NGS를 이용한 Microbiome 분석Abstract이번 실험에서는 직접 Swab을 이용해 피부와 두피의 미생물을 채취해, DNA를 토대로 DNA sequencing 방법 중 하나인 NGS를 통해 DNA가 형성하고 있는 Microbiome에 대해 분석하였다. NGS(Next generation sequencing)은 차세대 염기서열 분석 방법으로, 대량의 염기서열을 한 번에 취해 Data reference와의 염기서열 유사성을 토대로 Microbiome을 분석하는 방법이며, Sanger sequencing의 이후로 발명되었다. NGS를 위해 채취한 Sample을 증폭하는 Amplicon PCR을 진행하고, 이를 가시적으로 확인하기 위해 Agarose gel electrophoresis를 진행하여 확인했다. 순도 및 정확한 결과를 위해 PCR clean up을 진행했으며, 다시 Index PCR을 통해 Sample을 증폭하고, Indexing해주었다. 실험 과정 중, 피부의 DNA 농도는 실험실 전반적으로 낮게 나와 두피 DNA로만 실험을 진행했으며, 실험자 본인의 농도는 각각 피부가 1.418ng/ul, 두피가 0.815ng/ul였다. 이후 NGS를 위해 ilumina 사의 Miseq기기로 DNA의 Microbiome을 분석했다. Species를 제외한 분류에서 10만 이상의 Reads count로 정밀 분석이 되었다고 판단하였으며, 가장 높은 Count를 가진 Kingdom분류의 경우, 99.69%의 rate 비율로 Bacteria였으며, Phylum기준으로 분석했을 때, 약 60%가 Firmicute였다. 또한 결과에 대한 간단한 해석과 실험적 과정에 대한 고찰을 포함한다.IntroductionMicrobiome이란 Microbiota(공생적, 병원성의 microorganism의 생태학적 집단)와 Genome(유기체의 유전적 정보의 총체)이 합쳐진 단어로, 일상에서 찾아볼 수 있는 Microorganism community의 총체이의 Elution buffer를 사용하여 남은 Salt를 제거한다. 이렇게 얻어진 DNA는 Spectrophotometer를 통하여 흡광도 측정을 통해 농도를 측정할 수 있다. 측정을 위한 Solution에서는 각각의 물질이 최대 흡광도를 띠는 파장이 다른데, 260nm에서는 DNA, RNA가 최대 흡광을 띠며, 230nm에서는 탄수화물, phenol, EDTA, 280nm에서는 단백질이 최대흡광을 띤다. DNA의 농도는농도(C) = 흡광도(O.D) * DNA 측정상수 * dilution factor위의 계산식을 통해 얻을 수 있다. DNA 측정상수값은 dsDNA의 경우 50ug/ml, ssDNA의 경우 33ug/ul이다. 최대 흡광도를 띠는 각 파장에서의 값을 토대로 DNA의 순도를 결정할 수 있다. O.D260/O.D280이 1.8~1.9 사이이고, O.D260/O.D230이 1.7~2.0 사이면 DNA의 순도가 높게 나온것이라고 볼 수 있다.NGS란 Next generation sequencing의 약자로, 처리량이 빠르고, 확장성 및 속도가 빠른 Parallel sequencing기술이다. 전체적인 Genome, DNA나 RNA의 Nucleotide sequence를 결정한다. DNA fraction, DNA library producing, flow cell attaching, primer binding, PCR extension, cluster forming, Signal scanning의 순서로 진행된다.PCR은 Polymerase chain reaction의 약자로, DNA의 Denaturation, Annealing, Elongation 세 가지 과정을 반복하면서 원하는 DNA부분을 증폭하는 기술로, 증폭하고자 하는 부분에 따라 Amplicon PCR, Index PCR등의 종류가 있다. Amplicon이란 Amplification이나 Replication의 원천이 되는 DNA나 RNA의 조각들로, Head to tail (Direct repegion이 가장 genus를 파악하기 쉬운 것으로 알려져 있으며, V6 region이 종을 분류하는 데에는 가장 정확한 것으로 알려져 있다. 이번 실험에서 사용하는 illumina사의 Miseq read length는 Pair-end sequencing으로 600bp 정도 이므로 V3~V4를 target으로 설정하여 진행한다.Agarose gel electrophoresis DNA가 음전하를 띠는 것을 이용해 분리하는 것으로 직류의 방향을 설정해서 흘려주면 Agarose를 포함한 Gel에서 DNA가 이동하여 눈으로 확인하거나 원하는 DNA 부분만을 얻을 수 있게 해준다. DNA의 이동 속도에는 분자 크기나 Gel 농도 등 다양한 요인이 작용하며, DNA visuallizing agent로는 EtBr이나 조금 더 안전한 GreenstarTM Nucleic acid staining solution을 사용한다. EtBr은 330nm의 빛을 흡수해 589nm의 주황색 가시광선을 나타내며, GreenstarTM은 496nm의 형광파장을 흡수해 522nm의 가시광선을 나타낸다. 이외에도 TAE(Tris-acetic acid EDTA)나 TBE(Tris-boric acid EDTA)가 Buffer로 사용된다.Materials and Methods1.5ml E-tube와 ST buffer를 준비하고, 두피(Scalp)와 귀 뒤(Skin)에서의 Sample 채취를 위해 Swab을 통해 50회 이상 긁는다. Swab의 면 부분을 1.5ml E-tube에 넣고, ST buffer를 300㎕를 넣고 10초간 Vortexing, Spin down을 한 뒤에 10분간 RT에서 Incubation한다. Proteinase K를 15㎕넣고 Lysis buffer를 300㎕넣은 뒤, 3초간 Vortexing한다. 그 다음 20분간 70℃의 온도에서 Incubation한다. 그 다음 Elution buffer를 55℃의 온도에서 Prewarming한다. 위의 Incubation이 끝나면 4℃40분정도 식혀 굳힌다. 만들어진 Gel을 전기영동 Chamber에 넣고, 0.5X TBE buffer를 적정선까지 넣은 뒤 EtBr을 넣는다. 맨 앞에는 7㎕의 100bp ladder를 loading하고, 두 번째 lane부터 DNA를 loading한다. 5㎕의 PCR product에 7㎕의 1x loading dye를 섞은 뒤, Lane에 loading한다. 30분간 130V 조건에서 전기영동을 진행하고, UV를 통해 결과를 확인한다.Table.2 Index PCR solutionPCR clean up 과정은 진행하지 않았으며, PicoGreen assay를 위해 100㎕ Standard dilution을 넣은 후, 2㎕의 Sample을 넣어 98㎕의 1x TE buffer를 넣고 섞는다. 100㎕의 PicoGreen을 well에 넣고 흔들어 섞는다. Spin down 한 뒤에 10분간 RT에서 Incubation한 뒤 농도를 측정한다.Data & Results피부, 두피 DNA농도Table.3 피부, 두피의 DNA 농도.피부두피DNA농도(ng/ul)1.4180.815Amplicon PCR product 전기영동 결과Fig.4. Amplicon PCR 젤 전기영동 결과, Red box, 약 550bp 크기의 DNA가 나왔다.Index PCR 결과 – 두피농도최종 농도 = 3.3ng/ulIndex i7 sequence = TACGCTGCIndex i5 sequence = TTATGCGANGSBasespace DNA read count – 두피 DNATable.4 Basespace reads countTotal readsReads passing quality filtering% reads passing quality filtering125,172125,172100.00%10만 Reads 이상으로, 정밀분석에 필요한 reads count보다 높은 수가 나와 분석이 잘 되었다고 생각할 수 있다.Table.5 NGS Taxonomic level 분석 결과 class 나왔다.Table.11 Top genus classification resultFig.11 Top genus classification resultMicrobiome을 Genus 기준으로 분석한 결과, Other가 47%, Veillonella가 21%, Streptococcus가 19%로 결과가 나왔다.Table.12 Top species classification resultFig.12 Top species classification resultReads count가 8만으로 정밀분석이 잘 안된 결과로 볼 수 있으며, Other 및 Unclassified의 결과가 높게 나왔다.Discussion이번 실험에서는 각각 귀 뒤의 피부, 두피에서 DNA Sample을 채취해 증폭 및 Sequencing을 통해 Microbial characterization으로 DNA가 이루는 Microbiome에 대해 분석해 Kingdom, phylum등의 기준으로 분석했다.우선 DNA Sample library를 만들기 위해 직접 Swab을 통해 DNA를 채취했는데, 실험자의 DNA Sample은 피부가 두피의 농도보다 80퍼센트 정도 더 높게 나왔지만, 실험실 전체의 피부 DNA농도가 낮게 나온 이유는, 첫번째로 귀 뒤에서 Sample을 채취하는 것으로 상처가 날 수 있어 약하게 해서 DNA가 많이 채취되지 않은 것일 수 있다. 두번째로는 Wash 및 Elution과정에서 DNA의 수득량이 적었을 수 있으며, Elution이 끝난 뒤 Sample을 옮기는 과정에서 Pipette으로 적정량을 옮기지 않았을 수 있다.Amplicon PCR 후에 Agarose gel electrophoresis한 결과에서, Ladder와 비교했을 때 16s rRNA V3-V4 region이 잘 증폭된 것을 확인했지만, DNA Band가 흐리게 나온 것은, PCR product와 Visualizing agent가 잘 반응하지 못해 부피차이와 같은 반응적 문제가 있을 수 있으며, DNA농도 자체가

자연과학| 2022.09.05| 17페이지| 3,000원| 조회(225)

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서강대학교 현생실4_광합성 세균의 성장, 광기구 결정 및 질소고정에 따른 수소형성

광합성 세균의 성장, 광기구 결정 및질소고정에 따른 수소형성Abstract이번 실험에서는 비유황 자색 광합성 세균인 Rhodobacter sphaeroides를 호기성, 혐기성 조건과 Fermentation, 광합성 조건에서 광도를 조절하며 성장시킴으로써 성장의 정도 파악하고, 각 광흡수 정도를 흡광도 측정을 통해 알아보아 광기구를 결정하였으며, 각 조건에 따른 R.sphaeroides의 대사과정으로부터 나오는 수소의 양을 측정하고 고찰해보았다. 총 3번에 걸쳐 실험을 진행했으며, 혐기성 조건에서는 산화성 인산화과정으로 성장하는 균체와 광합성조건에서의 광인산화 반응을 통한 성장을 볼 수 있었고, 발효에 의한 성장도 비교해보았다. 광합성 기구의 형성을 광도에 따라 달라지는 양상을 통해 파악했으며, B800-B850 광흡수체, B875광흡수체 및 Reaction center를 그래프로부터 파악했다. 또한 R.sphaeroides와 그 Mutant에서의 대사과정에서, 암모늄이온의 양에 따라 바뀌는 대사과정에서의 수소생성, 유전적 대사흐름의 변화로부터 생기는 수소생성의 변화를 GC Chromatography를 통한 값으로부터 결정하였다. 광합성 세균의 성장을 관찰했을 때 광조건인 photoheterotrophic조건, 빛이 없는 조건에서의 혐기성 호흡, Fermentation순으로 성장이 컸다. Klett unit값으로도 그 결과를 분석하였고, 지수적 시기에서 doubling time과 분열횟수를 계산하였다. 또한 광합성 기구의 흡광스펙트럼 결과 그래프를 통해 각 Wild type, Δpuc mutant, Δpuf mutant의 흡광 양상을 파악했으며, B800-B850, B875, Reaction center의 유무를 판단하였다. 또한 세 번째 실험에서는 NH4+의 유무에 따른 성장 및 수소생성의 변화와 효소의 변화에 따른 유전적 대사흐름의 변화를 통한 성장과 수소생성의 변화를 관찰하였다. 수소는 차세대 신에너지로 각광받고 있는 친환경에너지인 만큼, 지구의 가장 많포와 CMV와 B875의 농도를 비교해 Normalization한다. B875는 Light harvesting complex로써 875nm의 빛을 흡수하는 것을 뜻하며, R.sphaeroides의 광기구는 B800-850 Light harvesting complex와 B875, Light harvesting complex와 803nm 파장의 빛을 흡수하는 광반응중심체가 있다. 이러한 구조들은 모두 비공유결합으로, 만입세포막 내에 구조단백질, Carotenoid, bacteriochlorophyll이 포함된다. 만입세포막 내의 광기구들은 배열 및 구성이 특이적인데, B875광흡수체는 광반응중심체를 감싸고 있고, 비율은 대략 10:1 정도이다. B800-850 광흡수체는 puf지역을 감싸고 있으며, 비율은 광도에 따라 반비례로 변화한다.R.sphaerodies는 광합성을 통한 성장과정에서 필요 없는 환원력이 생기는데, 이를 제거하기 위해서 Nitrogenase를 사용해 H2 gas를 발생시킨다. Nitrogenase는 N2를 NH4+로 바꾼다. NH4+ 이온이 세포에 많이 존재한다면, Nitrogenase는 억제된다. 또한 Nitrogenase는 기질 특이성(Substrate specificity)가 낮아서 주변 양성자를 Reduction하여 H2를 발생하거나 C2H2의 Reduction을 통해 C2H4를 발생시키는 것이 가능하다. 이 C2H4의 Reduction은 Nitrogenase의 활성측정을 하는데에 쓰이기도 한다.질소고정효소 Nitrogenase는 지구의 비생물권에서 생물권으로의 질소 이동에 중요한 역할을 하며, NifH, NifK, NifD의 3개 단위체로 이루어져 있다. 기질의 환원은 NifH가 Reduced ferredoxin으로부터 받은 환원력을 환원 매개부위인 NifD와 NifK로 보내며 발생한다. NifH는 환원 단위체이며, NifD-NifK complex는 환원매개 단위체이다.Fig. 3 NitrogenaseNitrogenase는 특정 세균에종하고 28℃에서 진탕 배양하며, A600 1.0 혹은 100 Klett units가 될 때까지 배양한다. 동일 배지가 들어있는 6개의 18ml screw cap tube에 10 Klett unit 또는 A600 0.1이 되도록 초기 균체 농도를 설정하고 접종한다. 이때도 tube에 기체가 거의 없도록 가득 채운 뒤 캡으로 밀봉한다. 두 개의 배양 튜브는 알루미늄 호일로 감싼 뒤 28℃ 항온기에서 배양한다. 나머지 4개는 28℃ 항온기의 문 안쪽에서부터 간격을 10cm로 두고 세워 둔다. 그 후 유리문 바깥 쪽에 백열등을 킨다. 간격에 따라 튜브에 도달하는 광도가 달라지므로 성장의 정도가 달라진다. 배양 정도를 Klett machine이나 spectrophotometer로 측정한다.광합성 세균의 광기구 결정광합성 세균의 광기구 결정을 위한 실험으로 이전 실험에서 진행한 광합성 조건의 여러 광도에서 배양 R.sphaeroides 표준 균주, ICM buffer (10mM potassium buffer, 1mM disodium EDTA, pH7), high speed centrifuge, Ultracentrifuge, Sonifier cell disrupter, 350-900nm 파장이 Scan가능한 Spectrophotometer를 준비한다.광합성 조건에서 배양된 R.sphaeroides cell을 ICM buffer가 원래 배양한 부피의 2%가 되도록 하여 세척한 뒤 부유 시킨다. 세포 부유액을 Sonifier cell disrupter를 사용해 60% duty cycle로 4℃에서 3분동안 분쇄한다. Cell lysate를 4℃에서 10,000g로 10분동안 Centrifuge하며 큰 세포조각을 제거한다. 원심분리 된 상층액을 200,000g로 1시간 동안 4℃에서 Centrifuge하여 Pellet을 얻은 뒤 ICM buffer에 현탁 시킨 뒤 Spectrophotometer를 이용하여 광기구를 측정한다. 필요시 Lowry method를 사용하여 측정할 수e가 관찰되었고, 7시간이 지난 후 부터는 Stationary phase가 관찰되었다. 이외의 Fermentation조건에서는 균체의 성장이 시간이 지나도 미미했으며, Anaerobic respiration 조건에서는 접종 15시간 후부터 성장 양상이 관찰되었다. Anaerobic respiration 조건에서의 Doubling time을 구하기 위해 Exponential growth phase에서 x축을 t, y축을 ln(균체량)으로 설정하여 그래프를 그려보면, 다음과 같다.Fig. 8 Anaerobic respiration 조건에서의 균체의 Exponential growth phase, x축은 ln(균체량), y축은 time그래프의 추세선 식과 기울기를 통해 위에서 기술한 식을 토대로 계산해보면, 다음과 같은 결과가 도출된다.td =td == 10.4547…=10.455h또한 분열 횟수를 계산하기 위해 임의의 두 점에서의 값을 설정한다.Time1 = 21 , klett unit = 22Time2 = 35, klett unit = 55분열횟수 n은 22 * 2n = 55n = 1.3219…= 1.32Fermentation 조건에서는 Growth 및 Exponential growth phase가 관찰되지 않았으므로 Doubling time과 분열횟수를 구할 수 없고, Photoheterotrophic 조건에서의 그래프를 위와 동일한 조건으로 그리고 Doubling time을 구해보면 다음과 같다.Fig. 9 Photoheterotrophic 조건의 Exponential growth phase, x축은 ln(균체량), y축은 timetd =td == 3.22544…= 3.225h또한 분열 횟수를 계산하기 위해 임의의 두 점에서의 값을 설정한다.Time = 3 , klett unit = 20Time = 15, klett unit = 260분열횟수n은 20 * 2n = 260n = 3.7004…= 3.70(2) 광합성 세균의 광합성 기구 결정Fig. 10 광합성기구에 따른 Klett unit값 (성장량)Fig. 16 시간에 따른 Culture volume당 수소 생성량Discussion광합성 세균인 R.sphaeroides의 호기성 조건에서 흡광도를 구하여 Standard curve를 구해보았을 때, 접종 3시간부터 OD660이 증가하며 Exponential growth phase가 관찰되었으므로 호기성 조건에서 R.sphaeroides는 성장에 무리가 없는 것을 알 수 있었다.R.sphaeroides의 각 조건에서의 성장 양상을 tube를 육안으로 관찰하는 방법과 Klett unit을 측정하여 분석 해보았을 때, 접종 직후에는 별다른 차이가 없었지만, 접종 1주 후 부터는 그 차이가 확연히 보였다. 육안으로 tube를 관찰했을 때, 광조건인 photoheterotrophic 조건에서 가장 높은 성장을 보였으며, 그 다음으로는 빛이 없는 조건에서의 혐기성 호흡, 다음으로는 Fermentation이었다. Klett unit값으로도 그 결과를 분석한 결과, Photoheterotrophic 조건에서는 접종 후 3시간부터 급격한 성장이 보였지만, Fermentation의 경우 성장이 미미했고, Anaerobic respiration 조건에서는 15시간부터 성장이 보였지만, 성장 폭이 크지는 않았다.Anaerobic respiration조건에서의 성장 양상을 Doubling time과 분열 횟수로 파악하기 위해서, 균체량을 로그 값으로 계산했을 때, doubling time이 10.455hour, exponential phase에서의 분열 횟수를 구한 결과 1.32가 나왔으므로, Klett unit으로부터 구한 결과와 잘 맞는다고 볼 수 있다. Photoheterotrophic 조건에서 위와 같은 방법으로 구한 결과 doubling time은 3.225hour, exponential phase에서의 분열 횟수는 3.70으로 Klett unit으로부터 구한 결과와 잘 맞는다고 볼 수 있으며, 위에서 생각했던 성장 양상의 유추를 T2

자연과학| 2022.09.05| 23페이지| 3,000원| 조회(152)

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서강대학교 현생실4 Ti plasmid를 통한 Agrobacterium 형질전환과 Subcellular level로의 외래 유전자발현 조사, TLC를 통한 TAG분리

Ti plasmid를 통한 A. tumefaciens의 형질전환과 선별 및 subcellular level으로의 외래 유전자 발현 조사와TLC를 통한 TAG의 분리Abstract이번 실험에서는 외래단백질로부터 형질전환한 Agrobacterium tumefaciens를 통한 식물의 형질전환을 진행했다. Colony PCR과 eYFP 형광과 WoLFPSORT, TargetP를 사용한 가능성을 토대로 한 Subcellular localization을 파악했고, Nile red staining과 TLC를 통해 WRI1과 DGAT1의 관여로 생합성 된 TAG의 검출을 진행했다. Spectinomycin, rifampicin 항생제가 포함된 YEP agar plate의 사용으로 이 항생제에 저항성을 가진 Ti-plasmid를 통해 형질전환 A. tumefaciens를 선별하고 Colony개수를 통한 형질전환 효율을 계산한 결과 WRI1, DGAT1, MAGL4, MAGL10 모두 0.01ug/ul의 plasmid DNA농도에서 높은 형질전환 효율을 보였다. 또한 WRI1는 Colony PCR결과로 전기영동의 결과에서 Band가 관찰되지 않았으며, 이는 실험적 오류로 발생한 결과로 유추할 수 있다. 형광현미경의 관찰로 WRI1은 핵, MAGL4는 세포질, MAGL10은 세포막으로 localization되는 것을 파악할 수 있었으며, 아미노산 서열로 번역한 결과로 예측한 localization 수치는 MAGL4만 일치했다. Nile red staining과 TLC를 통해 식물 잎에서의 TAG생합성에 대해 알아보았는데, WRI1과 DGAT1이 포함된 Sample에서만 TAG의 형광신호가 잘 관찰되는 것과 TLC에서의 WRI1, DGAT1 결과가 많이 이동한 것으로 보아 WRI1과 DGAT1은 TAG 생합성에 관여한다는 것을 알 수 있었다. TAG는 중성지방으로써 바이오 디젤로 사용할 수 있어 그 의미가 크다.Introduction이번 실험의 사용할 Agrobacterium s되었는지를 형광의 방출로 파악할 수 있다. eYFP (Enhanced yellow fluorescent protein)을 사용하였으며, 이는 노란 형광을 띤다.Nile red(9-diethylamino-5H-benzo[a]phenoxazine-5-one)는 Intracellular lipid droplets 염색에 사용되며, 중성지방에 결합했을 때 515/585nm의 Yellow orange 형광을 띤다. 이번 실험에서는 WRI1, DGAT1에 의한 TAG(Triacylglycerol)의 검출에 사용된다. 이러한 형광은 원하는 빛만 선별해주는 Fluorescence microscope(형광현미경)으로 관찰이 가능하다.P19 protein은 Tombusvirus ORG4 gene에 coding되어있는 protein으로 실험적으로 외래유전자의 발현을 유도하기 위해 식물의 PTGS(Post-transcriptional gene silencing)을 통한 siRNA의 RISC와의 결합을 통한 발현억제를 저해하는 RNA silencing suppressor이다. P19는 siRNA에 결합해 작동한다.TAG(Triacylglycerol)은 중성지방의 한종류로, 3개의 OH기를 가진 glycerol과 3개의 Fatty acid가 Ester 결합을 통해 생성되는 compound이며, Non polar neutral lipid이다. 이 TAG의 검출에서, WRI1과 DGAT1은 TAG의 생합성에 관여하는데, WRI1은 TAG 생합성의 전자조절인자이다.TLC(Thin later chromatography)는 혼합물 속에서 성분을 분리하는 방법으로 고정상, 이동상, 혼합물 세 가지로 구성되어 Affinity에 따라 성분을 분리하는 방법이다. 고정상은 TLC plate로 Silica coating이 되어있어 극성을 띠며, 이동상인 전개용매는 Hexane 등의 유기용매로 비극성을 띤다. Spotting(점적), Developing(전개), Visualizing(시각화)의 세가지 과정ation하여 4~6hour, 28℃의 조건에서 shake incubating한다. 실험에 사용할 Infiltration solution의 조성은 다음과 같다.Table.4 Infiltration solutionCell을 Spectrophotometer을 통해 OD6000.8의 값이 나오는 것으로 확보하고 3min, 5,000rpm의 조건에서 원심분리한 뒤 Pellet만 남겨둔 뒤 위 조성으로 만든 1mL의 Infiltration solution을 넣고 섞어준다. 다시 3min, 5,000rpm의 조건에서 원심 분리하는 과정을 두 번진행한 뒤, OD6000.8의 조건으로 맞춰진 cell을 각각의 외래DNA와 p19를 1:1 비율로 섞은 뒤 담배 잎 뒷면에 syringe를 통해 Infiltration한다. Infiltration할 Sample의 조성은 다음과 같다.Table.5 20:1 diluted sampleTable.6 p19를 첨가한 Sample조성 (up to 1ml by Infiltration solution)위의 조성으로 준비된 Sample을 담배에 주입하고, 48시간 배양한다. 그 다음 잎을 1.5ml tube에 넣고 잠길 정도로 Nile red 용액을 넣어 30분간 염색시키고, pH 8.0 0.1M Tris-HCl로 5min wash를 총 두 번 한다. 두 과정 모두 knife로 0.5mm정도 Sample을 채취한 뒤 Slide glass와 Cover glass에 DW를 통해 올려놓고 덮어 Fluorescence microscope를 통해 관찰한다.3. Thin layer chromatography동결건조된 잎 3mg에 Chloroform과 methanol을 각각 2:1로 90ul로 넣고 쇠구슬을 2개 넣어 10min vortexing해준다. 그리고 30ul 0.1M KCl을 넣어 5min vortexing을 더 한다. 약 10,338rpm의 10,000xg, 5min의 조건으로 Centrifuge 후 Lower lipid phase를 채취한다.GKNECLGLGNLDCCEVVVGRESPTSSSSPLSCFSTDSASSTTTTTATTTSVSCNYSVFig.7 WRI1의 서열을 통한 WoLFPSORT 결과Website의 서열 변환 결과 Chlo : 8, nucl : 4, mito : 1으로 chloroplast의 가능성이 핵으로의 가능성보다 두배 높게 나왔다.Fig.8 WRI1의 TargetP 결과.Other가 0.9997, Mitochondrial이 0.0002, Chloroplast가 0으로 결과가 나왔다.WoLFPSORT에서는 Chloroplast로 가능성이 조금 더 높게 나왔고, 핵으로 갈 가능성도 나타났다. TargetP에서는 Chloroplast로 갈 가능성이 없다고 판단하였다. 따라서 형광현미경에서의 결과는 핵에서 localization된 것이 확인됐지만 website의 변환결과로 정확한 유추를 하는 것은 힘들다.(2) DGAT1 (아미노산 서열, WoLFPSORT, TargetP)MAILDSGGGGVSTATATENGGGEFVDLRRRKTRSDSNGVLSGSDNPPSDDVGAPADVRDRIDSVVNDDAQGTTANLAGDNEIRETGGGGGRGGGGEGGRGNAETTYTYRPSVPAHRRARESPLSSDAIFKQSHAGLFNLCVVVLIAVNSRLIIENLMKYGWLIRTDFWFSSRSLRDWPLFMCCLSLSFFPLAAFTVEKLVLQKCISEPVVIFLHIIITMTEVLYPVYVTLRCDSAFLSGVTLMLLTCIVWLKLVSYAHTNYDIRTLANSADKVNPDVSYYVSLKSLAYFMVAPTLCYQPSYPRSPCIRKGWVARQFAKLVIFTGFMGFIIEQYINPIVRNSKHPLKGDLLYAIERVLKLSVPNLYVWLCMFYCFFHLWLNILAELLCFGDREFYRDWWNAKSVGDYWRMWNMPVHKWMVRHIYFPCLRSKIPKTLAIIIAFLVSAVFHELCIAVPCRLFKLWAFIGIMFQVPLVFITNYLQERFGSTVGNMIFWFIFCIFGQPMCVLLYYHDLMNRKGS형질전환에서 서로 다른 plasmid의 농도를 수용성 세포에 넣어준 이유는 plasmid의 양에 따른 형질전환 효율을 관찰하기 위함이다. WRI1의 경우 1ug의 농도에서 형질전환 효율이 매우 낮았고, 0.1ug의 농도에서 보다 높은 형질전환 효율을 보였다. 1ug의 농도에서 현저히 낮은 형질전환 효율을 갖는 것은 너무 큰 DNA이거나 많은 양의 DNA를 형질전환 시킬 때 발생할 수 있는데, 농도가 낮아짐에 따라 다시 형질전환 효율이 올라가는 것으로 보아 많은 양의 DNA를 넣어줬기 때문으로 볼 수 있다. DGAT1의 경우 0.01ug/ul의 농도에서 높은 효율을 보였으며, MAGL4도 0.01ug/ul, MAGL10도 0.01ug/ul의 DNA농도에서 형질전환이 잘 일어난 것을 확인할 수 있었다. 따라서 Plasmid DNA의 농도에 따라 각 외래 단백질들은 서로 다른 농도에서 최적형질전환 효율을 가졌다.담배 잎을 동결건조 할 때 형질전환 된 담배 잎을 액체질소에 넣고 얼리는 이유는 조금이라도 있는 물을 없애기 위함이다. 얼어 있는 것을 저온에서 고온처리를 하며 승화가 일어나 물이 거의 없는 Sample의 채취가 가능하다. 이는 TLC에 사용할 Sample의 채취 시 물이 많이 남아있으면 수층이 두꺼워지므로 이를 줄여 주기 위한 방법으로 사용되었다.실험에서의 sample은 1250bp기준 1분 30초의 PCR을 진행했으며, PCR과정에서 colony를 resuspension 한 뒤 물에서 10분동안 끓여준 이유는 Cell에서 DNA만 꺼내기 위해 denaturation 과정을 유도한 것이다. 배지의 Colony와 Colony PCR을 통한 결과를 보았을 때, PCR product의 전기영동의 결과에서 WRI1의 Band가 나타나지 않는 것으로, WRI1의 형질전환에서 문제가 있었다고 생각할 수 있다. 이유로써 첫번째는 PCR solution에서 Cell lysate등의 물질을 실수로 넣지 않았을 수 있다. 두 번째 이유로는 WRI1에 대한 AgrobacterT2

자연과학| 2022.09.05| 23페이지| 3,000원| 조회(297)

서강대학교, 현대생물학실험, 현생실

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서강대학교 현생실4_전기생리학(Electrophysiology)

ElectrophysiologyAbstract이번 실험에서는 DOS Box simulator를 사용해 Neuron 프로그램을 통해 Squid giant axon에서의 Neuron data를 토대로, Voltage-clamp와 Current-clamp 조건에서의 실험을 진행했다. V-clamp를 통해 Na+(Sodium) channel과 K+(Potassium) channel의 Current 변화를 다양한 환경에서 Simulating해보고, C-clamp를 통해 Resting membrane potential과 Na+, K+, Cl-, Mg2+ 이온의 유무에 따른 환경변화에서 Equilibrium potential, action potential의 변화를 그래프를 통해 알아보았다. 또한 세포의 내 외부 이온 농도와 Channel conductance와 같이 환경조건 변화에 따른 이온농도 변화를 알아보고, 이 조건에서 IPSP(Inhibitory postsynaptic potential) EPSP(Excitatory postsynaptic potential)와, 이 환경에서 AMPA, NMDA, GABA receptor들의 이온에 따른 작용들을 알아봄으로써 각 특징을 컴퓨터 데이터로 알아보았다.Introduction동물 신체 조직의 모든 세포는 전기적으로 극성화(Polarized)된다. 즉, 세포막 전위라고 알려진 세포막의 전압차를 유지한다. 전기적 분극화는 Ion pump에 있는 단백질 구조와 Ion channel 사이의 상호작용에 관여한다. 뉴런의 막 중 일부는 활동전위를 생성할 수 있다 Membrane potential의 각 흥분성 부분은 두 중요한 단계를 거치는데, 세포를 교란시키지 않는 한 막전위가 유지하는 값인 Resting potential, 그 보다 높은 값인 Threshold potential(역치 전위)가 있다. 뉴런에 대한 Synapse Input은 탈분극 또는 과분극을 일으키며, 이는 Membrane potential을 증가시키거나 감소시킨다ical equilibrium에 기반한다. 이온은 구배에 따라 고저 농도로 이동하며, 정전기적으로 안정된 상태(Stable electrostatic state)에서 이동한다.Nernst equation은 단일 이온에 대한 Permeability를 나타내는 것으로 다음과 같은 식으로 표현 가능하다.Ex는 특정 이온 X에 대한 Equilibrium potential, R은 기체상수, T는 절대온도, Z는 전하, F는 페러데이 상수이다. 일반적으로 ENa는 약 40mV의 Equilibrium membrane potential을 띠며, EK는 약 -100mv에서 Equilibrium membrane potential을 가진다.GHK equation(Goldman-Huxley-Katz equation)은 다중이온에 대한 상대적 투과성을 표현하는데, 식은 다음과 같다.GHK eqaution을 통해서 Resting potential을 계산할 수 있다. Resting potential에서는 leak channel이 세포 내 외부의 이온 농도를 일정하게 유지시키기 때문에 일정한 전압을 유지한다. Conductance(G)= 1/R이며, P는 Permeability, pKleak = leak K+ channel permeability, pNaleak은 leak Na+ channel permeability를 나타낸다.Materials and MethodsV(voltage)-clamp는 Membrane voltage를 일정하게 유지하고, Membrane의 channel을 통해 흐르는 Ion current를 측정하는 것으로, Voltage는 membrane potential이다. Membrane potential은 세포 내 외부의 전하량 차이로 인해 생기는 Voltage potential이다. 세포에 인가되는 전류는 설정된 전압에서 세포막을 가로지르는 전류와 같아야 하므로, 기록된 전류는 세포가 Membrane potential 변화에 어떻게 반응하는지 나타내며, Voltage cla농도를 감소시키면, 세포안으로 유입되는 Na가 줄어들며, depolarization 또한 줄어들어 Action potential을 띠지 못한다.Fig.13 위의 조건에서 [Na+]0 10030으로 변경 (Blue line)파란색 선이 그려진 것을 보면, 더 큰 음의 값으로 구부러짐이 발생한 것을 볼 수 있는데, 이는 K의 Equilibrium potential에 더 가까워지는 것으로, Na의 양이 적어 짐에 따라 그 영향이 줄어들어 Hyper polarization이 많이 일어나게 되는 것을 알 수 있다.Fig.14 위의 조건에서 [Na+]0 300.1로 변경 (Blue line)파란색 선을 보면 Na의 양이 전보다 더 줄어들었기 때문에 K의 Equilibrium potential인 -100mV까지 Hyper polarization이 일어난 것을 확인할 수 있다.Fig.15 위의 조건에서 Base Current를 02.25로 변경 (Blue line)파란선을 보게 되면 기본전류를 2.25 높여 4.25가 되게 하여 자극이 부족해서 보이지 않았던 Action potential을 조절하는 것으로, 과분극이 줄어든 것을 볼 수 있다.Fig.16 위의 조건에서 Base Current를 2.254로 변경 (Blue line)외부자극을 증가시켜서, 역치에 도달했지만 Action potential은 생기지 않았다. 따라서 Na의 유입이 없다면 Action potential이 생기지 않는 것을 알 수 있다.Fig.17 ACTIVE.CCS에서 [K+]0 3.10.1로 변경Blue line은 주어진 자극에 대한 Potential이며, Hyperpolarization이 일어났다. 세포외부의 K가 낮고, 세포 외부로 유출되던 K가 유입되었기 때문이며, 역치에 도달하지 못해서 Action potential이 생기지 못한다.Fig.18 위의 조건에서 Base current를 00.8로 변경외부 자극을 0.8로 증가시켰다. 따라서 Action potential이 형성되었다. K+의 영 outward current만 생기며, Membrane potential이 커질수록 Driving force가 증가해서 Current가 커진다. 또한 K channel이 계속 활성상태를 유지하기 때문에 시간이 지나면 수평 그래프가 표시된다.Fig.26 위의 조건에서 gNa(0-20uS) 010, gK(0-2uS) 20으로 변경이 조건에서는 Na에 의한 Inward current만이 발생하며, Membrane potential의 증가와 함께 Voltage-gated channel이 활성화되어 Current가 증가한다. Electrochemical motive force에 의해서는 Na의 유입이 감소하여 Current가 감소하고, Na channel의 비활성화와 함께 Current가 사라진다. Membrane potential이 50mV이상이 되면 Na의 Driving force로 인해 Outward current가 생긴다.10. Analysis of amplitude and time course of individual currentsFig.27 C-clamp, GNA_K.CCS 실행결과이 조건에서는 Action potential이 생겼을 때 Na, K channel의 Conductance 변화를 관찰할 수 있다. Potential이 역치에 도달하면 Na의 Conductance가 증가하며, K의 Conductance는 약간 늦게 증가했다가 감소한다. 그 다음 Na channel이 비활성화 되면 K channel이 열려 Action potential이 생기고, hyperpolarization이 발생한다. K channel에 의해 낮은 전압의 Resting potential로 hyperpolarization되며, leak channel에 의해서 Resting potential로 회복된다.Fig.28 ACTN_POT.CCS 실행결과Action potential에서 Ion current를 보는 것이다. Resting 상태에서 Na channel이 Inactivatedurrent를 띠다가 Outward current를 가지는 것을 Reversal potential이라 한다. -100mV에 가까울수록 Na의 Driving force가 증가하지만 Mg가 NMDA를 막고 있어서 유입은 적다. Membrane potential이 커지면 K의 유출이 증가해 Mg를 제거함으로써 Na의 유입이 증가한다. 그 후에는 Na의 Driving force가 감소한다.Fig.41 위의 조건에서 [Mg2+]out 10.001로 변경이 조건에서는 -100mV에서 K의 Driving force가 없으며, Na의 유입이 많이 일어나는 것에 따른 결과이다. 따라서 -100mV에서 가장 큰 Inward current를 띤다.Fig.42 위 조건에서의 Current와 Membrane potential 사이 관계외부 Mg농도를 0에 가깝게 설정하면, Na의 Driving force로 인해서만 Current가 변화한다. -100mV에서 inward current가 크고, K의 Driving force 증가로 인한 Outward current의 증가는 천천히 일어난다. -100mV에서 -80mV에서는 Non-linearity를 띠는데, 조금 남아있는 Mg가 membrane potential의 음의 값을 가질 때 NMDA를 막기 때문이다.Fig.43 위의 조건에서 [Mg2+]out 0.0010.05로 변경세포 외부 Mg의 농도를 이전 조건보다 50배 높였을 때의 결과이며, 음 값의 Current 폭이 줄어든 것을 확인할 수 있으며, Mg가 외부에 많으면 세포 내부나 Receptor에서 Mg 유출이 적기 때문에 Na의 유입도 적어져 나타난 결과이다.Fig.44 위 조건에서의 Current와 Membrane potential 사이 관계-50mV에서 가장 큰 Inward current를 보여준다.Fig.45 위의 조건에서 [Mg2+]out 0.050.01로 변경Fig.46 위 조건에서의 Current와 Membrane potential 사이 관계위 두 그래프도 Mg에 의T2

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서강대학교 현생실4_세포분획(Cell fracionation)_결과레포트

Cell fractionationData & ResultsFig.1 근육세포의 Nucleus(좌), Mitochondria(우)Fig.2 간세포의 Nucleus(좌), Mitochondria(우)Fig.3 뇌세포의 Nucleus(좌), Mitochondria(우)Fig.4 심장세포의 Nucleus(좌), Mitochondria(우)Discussion이번 실험에서는 Mouse의 기관과 조직 별 세포를 채취하고 그 안에서 Nucleus와 Mitochondria 소기관을 Homogenization과 Centrifugation을 포함하는 Cell fractionation 방법을 통하여 추출한 뒤, 염색하여 현미경으로 관찰하였다. Nucleus 염색약으로는 +Charge가 핵산과 결합하여 Blue, Blue-green을 띠는 Methyl green을 사용하였고, Mitochondria염색에는 산화상태에서만 Blue color를 띠는 Janus Green B를 사용하였다. 실험과정에서 Mitochondria는 Nucleus보다 원심분리과정이 한 번 더 필요하기 때문에 Nucleus를 먼저 염색 관찰 후, Mitochondria를 염색 관찰하였는데, Mitochondria는 염색이 빨리 사라지기 때문에 Nucleus의 관찰 중간에 Mitochondria를 먼저 관찰하였다. 찾고자 하는 모든 세포 소기관이 관찰되었지만, 대체적으로 많지 않았고, 근육세포의 mitochondria를 제외한 다른 세 가지 Sample의 Mitochondria의 염색이 진하게 되지 않은 것을 볼 수 있었다. 이는 Mouse에서 Sample을 채취하고 Buffer와 섞은 뒤 원심분리와 상층액을 사용하는 실험 과정 중에서 Sample의 loss가 발생해 생긴 결과로 생각해볼 수 있으며, 염색이 진하게 되지 않은 것은 Sample과 염색약을 섞는 과정이 부족했을 수 있다.PAGE * MERGEFORMAT2

자연과학| 2022.09.05| 4페이지| 3,000원| 조회(188)

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