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전기영동 SDS sample loading buffer를 사용하는 이유, running gel에서 단백질 분리가 일어나는 원리

단백질 전기영동전기영동(Electrophoresis)-용액 중의 전하를 띈 물질이 전기장 내에서 이동하는 현상여기서 말하는 하전물질은 buffer 성분을 제외한 peptide, 단백질, 핵산(DNA, RNA) 등 수용액 속에서 ＋또는 一 전하를 가진 물질을 말하는데, 흔히 말하는 전기영동 시료임SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate?polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)- 단백질은 독특한 charge와 PI 값이 있기 때문에 이들의 charge를 동일하게 바꿔서 전기장을 걸어주는 전기영동법이 SDS-PAGE임-Gel 전기영동법에 한천 겔 대신 Polyacrylamide gel을 이용하는 방식- 두 개의 gel의 pH 차이로 단백질을 분리하는 원리-단백질은 구성하는 아미노산에 의해서 (+), (-) 상관없이 어느 쪽이건 전하를 띄지만 SDS가 결합(SDS 처리)함으로써 일시적으로 (-)하전을 띄어 모든 분자를 양극으로 이동시키고, gel의 pore 사이즈에 의해서 분자량의 크기에 따라 각각의 단백질을 분리할 수 있다. 이 단백질들의 이동성은 분자량에 대수적으로 선형인 함수 관계를 가짐1. 단백질 전기영동 시 SDS sample loading buffer를 사용하는 이유는 무엇인가?loading buffer에 보통 Bromophenol Blue가 들어있어 전기영동이 되는 동안 DNA band가 얼마만큼 내려가는지 진행 정도를 확인할 수 있도록 한다. 전기영동 시 단백질을 loading buffer와 섞는데, 이는 단백질이 파란색을 띠게 하고 분자량이 큰 물질이 들어있어서 DNA를 Agarose gel의 well에 loading 할 때 DNA 시료 무게를 무겁게 하여 퍼지지 않고 단백질 시료가 물에 뜨지 않고 agarose 홈에 잘 가라앉도록 해준다.2. Polyacrylamide gel을 만들 때 stacking과 running gel로 구분하는 이유와 running gel에서 단백질 분리가 일어나는 원리는 무엇인가?stacking과 running gel로 구분하는 이유stacking gel과 running gel은 acrylamide의 함유량도 차이를 보이지만 pH의 차이가 두 gel이 다른 역할을 하게 하는 핵심요소이다. Sample을 loading 한 후 전기장을 걸어주면 단백질을 비롯한 여러 이온들이 gel을 이동하게 되는데 이 이온들에는 Cl-와 glycine 이온들이 있다. 이 이온들은 electrophoresis buffer 내에 함유된 이온들로서 이 두 이온이 단백질의 이동에 큰 역할을 하게 된다. running gel의 acrylamide 농도에 따라 gel 그물구조 크기가 달라지면 이를 이용하면서 단백질 이동속도를 조절할 수 있다.Glycine 이온은 net charge가 0이 되는 pI 값이 6.2인데 stacking gel의 경우 pH가 6.8이므로 이로 인해 Cl-와 glycine 간의 이동속도의 차이가 생기게 된다. Cl-, 단백질, glycine은 모두 (-)를 띄게 되는데 Cl-는 그 분자량이 아주 작기 때문에 가장 빨리 내려가게 되고 glycine은 일부만 (-)를 띄기 때문에 이동속도가 가장 느리게 된다. 따라서 이동속도는 Cl->단백질>glycine 순서가 된다.Running gel의 경우 pH는 8.8 정도로 이제 Glycine은 완전히 이온화가 되어 모든 단백질보다 빠르게 움직일 수 있게 된다. 즉 Running gel에서의 이온들의 이동속도는 Cl- > Glycine > 단백질 이온의 순서가 된다.따라서 running gel과 stacking gel은 pH 농도가 달라서 결과가 다르게 나오기 때문에 Polyacrylamide gel을 만들 때 stacking과 running gel로 구분하는 것이다.running gel에서 단백질 분리가 일어나는 원리Polyacrylamide gel은 그물 모양의 입체구조를 가지고 있어서 시료에 대하여 분자를 걸러내는 역할을 한다. 작은 물질은 빠르게, 큰 물질은 느리게 이동하여 분자량에 따라 분리할 수 있다. Running gel은 stacking gel과는 달리 pH가 8.8이기 때문에 glycine이 완전히 이온화되게 된다. 이동속도가 Cl-> glycine> 단백질로 바뀌기 때문에 Cl-와 glycine 사이에 형성되었던 high voltage gradient가 거의 사라지게 되고 단백질의 이동은 자신의 분자량에 영향을 받게 된다. 또한 acrylamide의 농도가 높아져 gel 내부의 그물구조가 더욱 촘촘해지는 것도 단백질들의 이동속도 차이를 더욱 높이면서 단백질은 분자량에 따라 분리가 된다. 따라서 단백질 시료 중 크기가 작은 단백질은 아래쪽으로 빨리 내려가고, 크기가 큰 단백질들은 위쪽에서 천천히 내려오게 되면서 단백질 분리가 일어난다.참고문헌)1. http://www.dynebio.co.kr/yc/bbs/board.php?bo_table=data1&wr_id=7&sst=wr_hit&sod=desc&sop=and&page=12. https://blog.naver.com/no9v2/401779528943. https://m.blog.naver.com/qpting/*************. https://m.blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=tjgmlapdlf&logNo=100090306593&proxyReferer=http%3A%2F%2Fwww.google.co.kr%2Furl%3Fsa%3Dt%26rct%3Dj%26q%3D%26esrc%3Ds%26source%3Dweb%26cd%3D3%26ved%3D2ahUKEwjY29efwtboAhUtyosBHWy2AGcQFjACegQIAxAB%26url%3Dhttp%253A%252F%252Fm.blog.naver.com%252Ftjgmlapdlf%252F100090306593%26usg%3DAOvVaw2Fpmtl7a31z2xfhqPavIJq5. https://m.blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=kbda11&logNo=70084125145&proxyReferer=http%3A%2F%2Fwww.google.co.kr%2Furl%3Fsa%3Dt%26rct%3Dj%26q%3D%26esrc%3Ds%26source%3Dweb%26cd%3D5%26ved%3D2ahUKEwj_8qHFx9boAhUNHXAKHZEfB7IQFjAEegQIAhAB%26url%3Dhttp%253A%252F%252Fm.blog.naver.com%252Fkbda11%252F70084125145%26usg%3DAOvVaw3o-DFXi_mnfq46G4AfM77m

자연과학| 2024.05.16| 2페이지| 1,000원| 조회(147)

단백질, Buffer, 전기영동, SDS, gel, Running buffer

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단백질 1차,2차,3차 구조에 대한 질문

2-1. 단백질 1차구조란 무엇인가요?1차 구조는 아미노산 서열 한 개의 단백질이 가지는 구조는 상호작용하는 다른 분자들과 환경에 의해서 바뀔 수 있다. 이러한 구조의 변형은 단백질의 생물학적인 기능인 촉매 작용, 다른 분자와의 결합, 기계적 움직임 등에 매우 중요한 역할을 한다.단백질의 일차 구조를 결정하는 첫 번째 단계는 어떤 아미노산이 어떤 비율로 존재하는가를 결정하는 일이다. 두 번째 단계에서는 단백질 서열의 아미노말단과 카복실말단의 아미노산을 결정한다. 이 절차는 서열 결정법이 향상됨으로써 점차 꼭 필요한 단계는 아니게 되고 있다. 그러나 단백질이 하나의 펩티드사슬인지 아닌지를 확인하는데 필요한 단계이다.2-2. 단백질 2차구조의 종류가 무엇이며, 각각의 종류에 대하여 설명하시오단백질의 2차 구조는 단백질의 1차 구조가 펩타이드 결합간의 수소결합으로 인해 나타나는 구조를 말한다. 단백질의 2차 구조의 종류는 알파나선 구조와 베타 병풍구조가 있다.알파나선구조는 하나의 폴리펩티드사슬 골격에 있는 수소결합으로 안정된다. N말단에서 시작하여 각 아미노산의 C=O기는 공유결합 서열 상으로 그 곳에서 네 개의 잔기 만큼 떨어진 아미노산의 NH기와 수소결합을 하고 있다. 나선 구조는 수소 결합에 관련된 원자들을 일직선 배열이 가능하게 함으로써 결합을 가장 강하게 하여 나선 구조를 매우 안정되게 한다.알파나선 형태에서 모든 곁사슬은 나선의 안쪽으로는 충분한 공간이 없기때문에 바깥쪽으로 향해있다. 폴리펩티드 사슬이 오른쪽 방향으로 나선상 꼬여 있으며 사슬의 골격은 긴 축을 따라 견고하게 감겨져 있고, 아미노산 잔기의 R기는 나선상의 골격으로부터 바깥쪽으로 돌출되어 있다.베타-병풍에 있어서 원자 배열은 알파-나선과는 완전히 다르다. 베타-병풍에서의 펩티드 골격은 거의 완전히 펼쳐져 있다. 인접한 사슬에 있는 펩티드 결합들 사이의 수소결합에 의해 유지되는 매우 경직된 구조이다. 많은 단백질의 중심부에 광범위하게 존대한다. 수소 결합은 서로 다른 사슬 사이에서 형성되거나 하나의 사슬이 되돌아 이중으로 중첩된 경우에 같은 사슬의 서로 다른 부분 사이에서 형성된다. 펩티드사슬들이 N 말단이나 C 말단을 기준으로 모두 같은 방향으로 배열되면 평행 병풍을 이루지만 교대로 반대 방향으로 배열되면 역평행 병풍이 형성된다. 베타-병풍의 펩티드사슬 사이의 수소결합은 반복적인 지그재그모양을 이루기 때문에 병풍이라는 이름을 갖게 되었다.2-3. 단백질 3차구조에 관여하는 결합은 어떤 것이 있으며 각각에 대하여 설명하시오3차구조는 아미노산의 곁사슬 사이의 여러 비공유결합에 의한 소수성결합, 수소결합, 이황화결합에 의하여 알파나선구조나 베타병풍구조 등의 2차구조를 갖는 부분이 불규칙한 구조를 갖는 부분을 통하여 접혀 일정한 배치를 형성하며 생성된다. 단백질의 3차 구조는 분자 내 모든 원자들의 삼차원적 배열이다.1. 수소결합은 구조를 유지시키는 힘이 된다.2. 이황화결합은 시스테인 곁사슬 사이에 공유결합을 형성한다. 이 결합은 펩티드사슬이 접힐 수 있는 형태를 제한한다. 이황화결합의 위치에 대한 결과와 일차 구조에 대한 결과를 합하여 단백질의 완전한 공유결합구조를 밝힌다.3. 소수성결합(반데르발스 힘)물 분자와 친하지 않기 때문에 그들끼리 결합하려는 성질을 말한다.4. 이온결합은 양이온과 음이온이 서로 정전기적 인력에 의해서 결합하는 것이다.2-4. 2-3에서 언급한 결합에 참여하는 아미노산을 나열하시오. 예를 들면 이황화결합(Disulfide bond) - 시스테인(cysteine, cys, c)

자연과학| 2021.01.17| 3페이지| 1,000원| 조회(427)

구조, 단백질3차, 단백질1차, 단백질2차

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해양동물내분비학 간단한 퀴즈

해양동물 내분비학 간단한 퀴즈화학물질의 종류로서 안병에서 분비되는 호르몬-단백질성 V호르몬갑각류의 X기관과 sinus기관을 척추동물과 비슷한 유사한 기관?- 시상하부- X기관- 뇌하수체 후엽- sinus절지동물들은 탈피를 빠르게 해야 하는지?-생존을 위해서. 탈피를 하면 가만히 있게 되는데 그때 포식자로부터 잡아 먹힐 수 있기 때문에 빠르게 탈피를 해야한다.MIH가 안병에서 높은 호르몬분비하면 Ecdysis 분비x →탈피x조웅선 위치가 어디며, 만들어지는 화학적 물질이 뭐임?-제 5보각 안쪽에 한 쌍으로 위치조면소포체에서 만드는데 펩타이드성 호르몬조웅선- 수컷에 존재엑다이슨 수용체는 어디에 존재하는가-큐티킁 바로 아래 상피에 존재조웅선과 가장 유사한 척추동물의 어떤 호르몬과 유사함?-인슐린게, 갑각류 탈피 호르몬- MIH, 엑다이슨 (MIH↑, 엑다이슨↓)안병에서 작용하는 생리현상 생리기구를 조절하나?-눈 자루에서 분비하는 난황형성억제 호르몬(생식소 발달)탈피억제, 혈당상승, 색소응집, 색소확산가장원시적인 동물-무악류포유류 내분비기관- 태반무척추동물에서 가장 종 수가 많은 류는?- 절지동물(Arthropoda)해양동물 갑각류 어떤 문에 속함?- 절지동물문조개 같은 것들 이매패류, 두족류, 복족류- 연체동물문

자연과학| 2021.01.17| 2페이지| 1,000원| 조회(138)

갑상선, 내분비학, 해양동물내분비학

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오메가3, 오메가6, 오메가9 정의와 특징과 차이점

오메가3탄소 사슬의 끝에서 세 번째 탄소에서부터 이중 결합(C=C)이 시작되는 필수 불포화 지방산이다.불포화 지방산은 인체 내에서 합성되지 않지만 대사활동에 필수적인 분자들이다. 필수 지방산의 두 가지 종류 중의 하나가 오메가-3 지방산이다.도코사헥사엔산(DHA)는 두뇌개발 및 신경조직을 안정시켜주고 안과 질환을 예방해준다. 뇌, 신경, 눈 조직의 구성에 필수적인 것으로 알려져 있다.알파-리놀렌산(ALA)은카놀라유, 아마, 월넛 같은 식물에서 추출한 오메가-3 지방산이다. ALA는 체내에서 EPA와 DHA로 전환되기도 하지만 전환 효율성이 매우 낮고 현재 영양 상태를 비롯해 여러 가지 요인의 영향을 받는다.에이코사펜타엔산(EPA)는 심장질환이나 성인병 등을 방지해주고, 콜레스테롤을 감소시텨 관절염이나 뇌졸중등을 예방해준다.도코 사 펜타 엔 산(DPA)는 모유에 포함된 지방산으로 아이들의 신체 및 정신발달에 많은 도움을 준다.오메가?3 지방산의 일반적인 공급원은 생선 기름, 아마씨유, 들기름이 있다.오메가6탄소 사슬의 끝에서 여섯 번째 탄소에서부터 이중 결합(C=C)이 시작되는 필수 불포화 지방산이다. 보통 성장에 필요하고, 피부 및 모발 생성, 콜레스테롤 대사, 생식 기능 유지에 있어 중요한 역할을 수행한다.리놀레산(LA)는 2개의 이중결합을 갖는 불포화 지방산을 말한다.감마-리놀렌산 (GLA)는 보통 식물성 유지에서 발견되며 천역에서는 달맞이꽃이나 블랙커런트씨유, 보리지 오일 등에 함유되어 있는데, 혈중 콜레스테롤릐 수치를 낮추는 데 효과적인 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생체 내 합성에 꼭 필요한 물질이다.아라키돈산 (AA)는 4개의 이중 결합을 가진 불포화 지방산이다. 동물 세포막과 소포체 막의 인지질 속에 존재하며, 체내에서 합성할 수 없으므로 필수지방산이다.칼렌드산 (Calendic acid) 이코사디엔산 (Eicosadienoic acid)다이호모-감마-리놀렌산 (DGLA)도코사펜타엔산 (Docosapentaenoic acid )아드렌산 (Adrenic acid) 도코사디에노인산 (Docosadienoic acid )테트라코사테트라엔산 (Tetracosatetraenoic acid )트라코사펜타엔산 ( Tetracosapentaenoic acid )이 있다.오메가6에 많이 들어있는 기름은 옥수수유, 보라지 오일, 홍화유 이다.오메가9지방산의 메틸기 말단부터 세어서 9번째의 탄소가 이중결합을 갖는 일련의 지방산. 올레산이 여기에 속한다. 올레산 계열의 지방산이라고 하는 경우도 있다.올레산은 사람의 예비 지방에 가장 가깝다. 덕분에 신체는 음식과 함께 공급되는 지질의 지방산 구성을 재구성하는 데 자원을 낭비하지 않는다. 올레산은 세포막의 구성에 관여한다. 트리글리 세라이드를 다른 단일 불포화 화합물로 대체하는 경우, 생물학적 막의 투과성이 급격히 저하된다. 또한 cis-9-octadecene 지질은 인간 저장소의 퇴적 된 지방의 과산화를 늦추고 신체의 에너지원으로 작용한다.올레산은 식물성 기름 (올리브, 땅콩, 해바라기)과 동물성 지방 (쇠고기, 돼지 고기, 대구)에서 얻는다. 오메가3, 오메가6 과는 달리 오메가9는 산화되기 쉽지 않으며 통조림 식품, 프라이팬을 채우는 데 지질을 사용하기 위한 기초 역할을 합니다.

자연과학| 2021.01.17| 2페이지| 1,000원| 조회(167)

오메가6, 오메가3, 오메가9

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Membrane blocking 필요한 이유, blocking을 할 때 사용하는 시약, primary antibody와 secondary antibody로 구분하는 이유

Membrane blocking은 왜 필요하며, blocking을 수행하기 위해 사용하는 시약은 무엇이 있는가?Membrane blocking이 필요한 이유단백질을 membrane으로 옮기면 단백질이 memebrane을 완전히 다 뒤덮지 않고 군데군데 빈 공간이 생긴다. membrane은 단백질이 잘 붙는 성질을 가지고 있는데, membrane의 빈 공간을 메우지 않으면 항체와의 빈 공간의 비특이적인 결합으로 인해 우리가 보고자 하는 특정 단백질만이 깨끗하게 검출되지 않을 가능성이 높아진다. 그러므로 항체와 단백질의 비특이적인 결합을 줄이기 위한 blocking 과정이 필요하다.blocking을 수행하기 위해 사용하는 시약Blocking buffer는 일반적으로 3-5% bovine serum albumin (BSA)나 non-fat dry milk(skim milk)를 Tris-bufferd saline(TBS)에 Tween 20이나 Triton X-100이 포함된 용액에 녹여 사용한다. Blocking buffer를 membrane이 잠기도록 부어 blocking 하는데, 이 blocking buffer는 우리가 보고자 하는 단백질이 부착한 곳 외에 membrane 전체에 부착하여 우리가 보고자 하는 특이적인 단백질에만 antibody가 붙어 정확하고 깔끔한 결과를 얻을 수 있게 해준다.Western blot 항체 반응 시 primary antibody와 secondary antibody로 구분하여 사용하는 이유는 무엇인가?primary antibody는 특정 단백질 또는 기타 정제 또는 감지 및 측정 목적의 연구 대상 바이오 분자에 특이적으로 결합하는 면역글로불린이다. primary antibody는 찾고자 하는 단백질에 특이적으로 붙도록 디자인한다.primary antibody를 인식하여 붙는 항체를 secondary antibody라고 한다. secondary antibody에는 효소, 형광물질, 방사성동위원소 등을 붙여 사용한다. secondary antibody에는 형광물질을 제공하여 시각적으로 확인할 수 있게 해주는 horse radish peroxidase(HRP)가 결합 되어 있는데, 이러한 secondary antibody가 primary antibody에 결합하여 우리가 원하는 단백질을 형광으로 발색시켜주어 눈으로 확인할 수 있도록 하고, 신호를 증폭시키는 효과가 있다.Western blot에서 항체를 쓰는 이유는 세포에서 생산되는 그 많은 단백질 중에서 어느 특정 단백질의 존재 혹은 양을 파악하려는 것이다. 이 단백질을 인식하는 항체가 primary antibody이다. 보통 표적에 붙은 variable region이 아닌 constant region에 표지를 붙인다. 어떤 경우는 방사성 동위원소, 어떤 경우는 칼라 반응을 시키는 효소를 붙이게 된다. 그럴 경우 방사성 동위원소의 위치 혹은 칼라반응되는 위치로 그 단백질의 부위를 찾아낼 수 있지만 그 과정이 경비가 많이 들고 까다롭다. 그래서 secondary antibody에는 형광물질을 제공하여 시각적으로 확인할 수 있게 해주는 horse radish peroxidase(HRP)가 결합되어 있는데, 이러한 secondary antibody가 1차 antibody에 결합하여 우리가 원하는 단백질을 형광으로 발색시켜주어 눈으로 확인할 수 있도록 한다.secondary antibody는 primary antibody의 constant region을 표적으로 한다.이 secondary antibody를 대량으로 만든 다음 여기에 표지를 부착시키면 이 secondary antibody는 전 세계 모든 과학자들이 만든 primary antibody를 인식한다. 그래서 각 실험실에서는 자신들이 연구하는 물질에 대한 primary antibody만 만든 다음 secondary antibody는 구입해서 사용하므로 저렴하고 효율적으로 실험을 할 수 있다.

자연과학| 2020.10.21| 2페이지| 1,000원| 조회(369)

primary antibody, Secondary antibody, Memb..

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