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효소(Enzymes)

효소 (Enzymes)Ⅰ. 요약 (Abstract)이번 실험은 기질의 농도, 온도와 산성도에 따라 효소의 활성도가 어떻게 바뀌는지 살펴보고, 각각 어느 지점에서 최대 값을 갖는가, 최대 지점이 아닌 부분에서는 어떤 모습을 보이는가 관찰하는 실험이었다. 먼저 이번 실험의 기질인 ONPG를 분해를 촉매하는 효소 ß-galactosidase를 이용해서 ONP를 만들었다. 그 후 ONP가 420nm에서 최대 흡광도를 보인다는 점을 이용해 Spectophotometer를 이용해 흡광도를 측정함으로써 생성물의 양을 측정했다. 첫 번째 실험은 기질의 농도에 따른 흡광도를 확인해보는 실험이었다. 기질의 농도를 각각 100, 250, 500으로 함으로써 기질의 농도에 따른 결과를 확인했다. 결과는 농도가 높을수록 시간에 대한 흡광도의 기울기가 더 가파르게 나타났다. 두 번째 실험은 온도에 따른 흡광도를 확인하는 실험이었다. 각각 4°C, 25°C, 37°C, 60°C, 90°C의 온도에서 흡광도를 측정했다. 결과는 37°C에서 최대 흡광도를 보였고 37°C가 넘어가자 흡광도가 급격히 감소했다. 세 번째 실험은 산성도에 따른 효소의 활성 정도를 확인하는 실험이었다. 각각 pH 3.0, 5.0, 7.4, 9.0, 12의 산성도에서 흡광도를 측정했다. 결과는 pH 7.4 부근에서 최대 흡광도를 나타냈고 pH가 더 커지자 흡광도가 급격히 감소함을 확인할 수 있었다. 세 실험을 통해 효소는 단백질로 이루어져 있으며 온도나 산성도와 같이 단백질의 구조에 영향을 미치는 요인에 따라 효소의 활성 정도도 크게 달라짐을 알 수 있었다. 그리고 기질의 농도가 커질수록 효소가 기질과 충돌하는 빈도도 커져 효소 반응이 더 활발하게 일어남을 알 수 있었다.Ⅱ. 서론 (Introduction)이번 실험은 기질의 농도, 온도 그리고 산성도에 따른 효소의 반응 속도 차이를 알아보는 실험이었다.생물이 생명을 유지하기 위해서는 다양한 화학 반응이 끊임없이 일어나야 한다. 근데 이런 화학반응이 끊임없이 일어나기고 새로운 결합을 형성할 수 있다. 효소는 생물 안에서 촉매의 역할을 하는데, 이 반응에 참여하는 물질을 기질이라고 한다. 그리고 효소와 기질이 붙어서 결합된 상태의 물질을 효소-기질 복합체라고 한다. 효소만의 특이한 성질은 단백질의 3차 구조에 의해 결정된다. 효소의 구조 중에는 기질의 특정 부위와 결합할 수 있는 활성 부위가 있는데, 이 활성 부위의 구조와 정확하게 들어맞는 기질이 왔을 때 효소-기질 복합체를 형성할 수 있다. 이와 같이 효소가 특정한 기질에만 작용하는 것을 효소의 기질 특이성이라고 한다. 비록 효소는 기질 특이성을 가지지만 기질과 효소의 활성 부위 사이의 결합은 결합하기 전부터 완벽하게 들어맞는 것은 아니다. 활성 부위에 어느정도 맞는 기질이 결합하게 되면 효소의 활성 부위 모양이 기질의 모양과 비슷해지는데, 이러한 현상을 유도 적합이라고 한다.효소 반응도 다른 화학 반응처럼 효소와 기질간의 충돌속도에 의해 반응속도가 결정된다. 따라서 효소의 작용에 영향을 주는 요인에는 기질의 농도, 온도 그리고 산성도 등이 있다. 반응속도에 영향을 주는 첫 번째 요인은 기질의 농도이다. 효소 반응속도는 효소와 기질이 충돌을 얼마나 자주 하냐에 따라 달라지기 때문에 효소의 농도를 증가시키거나 기질의 양을 증가시키면 충돌 횟수가 늘어나기 때문에 어느 정도까지는 반응 속도가 증가하게 된다. 하지만 너무 많이 증가하게 되면 모든 효소가 기질과 결합하여 더 이상 충돌할 효소가 없기 때문에 기질의 농도가 증가해도 초기 반응 속도는 더 이상 증가하지 않는다. 이렇게 효소 포화(enzyme saturation)에 도달하게 되면 반응 속도는 더 이상 증가하지 않고 일정한 초기 반응 속도를 유지한다. 두 번째 요인은 온도이다. 효소가 관여하는 화학 반응에서는 최적 온도가 될 때까지는 온도가 높아지면 반응 속도가 빨라진다. 하지만 최적 온도보다 온도가 높아지면 활성 부위의 입체 구조가 변성되어 기질과 반응하지 못하므로 반응 속도는 급격히 느려진다. 단백질을 비가역적이기 때있다. 이 때 ONPG의 가수분해를 촉매하는 ß-galactosidase에 의해 2개의 linkage가 끊어지게 되면 비색정량을 통해 황색을 관찰할 수 있다.Ⅲ. 실험재료 및 방법 (Materials and Methods)첫 번째 실험은 기질의 농도에 따른 효소 활성을 측정하는 실험이다. 첫 번째로 Micro test tube에 기질 양과 시간별로 labeling을 한다. 그 다음 각 Micro test tube 별로 와 같이 Na-phosphate buffer 와 ONPG를 넣는다. 이렇게 해서 완성된 각 Tube(buffer-ONPG mixture)를 5분간 37 °C water bath에서 예열해준다. 그 다음 각 tube에 ß-galactosidase를 100ul씩 넣어주고 37 °C water bath에서 각각 tube별로 0분, 5분, 10분, 15분동안 반응을 시킨다. 이 때 예열 후 water bath에서 꺼낸 다음 빠르게 ß-galactosidase를 넣고 Inverting을 해주어야 하고 Inverting 후 micro test tube의 모든 캡은 열어서 water bath에 넣는다. 이렇게 해준 후 각 시간마다 1 M Na2CO3를 200 ul씩 넣고 파이펫으로 천천히 섞어준다. 이때 캡은 닫지 않는다. 이런 과정을 통해 완성된 sample들을 Spectrophotometer로 각각의 Absorbance 값을 측정하여 기록한다. 이 때 blank는 0분으로 설정해야 한다.Na-phosphate buffer(pH 7.3) (ul)2mM ONPG (ul)ß-galactosidase(ul)최종 ONPG 농도85**************************0100500이 때 12개의 e-tube 준비는 처럼 해야 한다.0분100 uM250 uM500 uM5분100 uM250 uM500 uM10분100 uM250 uM500 uM15분100 uM250 uM500 uM두 번째 실험은 온도에 따른 효소 활성을 측정하는 실험이다. 이 실험에서는 먼저 M값을 측정하여 기록한다. 이 실험도 blank를 0분으로 설정한다.세 번째 실험은 pH에 따른 효소 활성을 측정하는 실험이다. 이 실험도 Micro test tube 별로 labeling을 한 뒤 pH 3, 5, 7.3, 9, 12의 buffer를 각 tube 별로 850 ul씩 첨가해준다. 그 다음 각 buffer가 들어 있는 tube에 4 mM ONPG를 50ul씩 첨가해준다. 그 후 각 tube를 37°C water bath에서 5분간 예열시킨다. 그 후 각 tube에 ß-galactosidase를 100 ul씩 첨가하고 37°C에서 10분간 반응시킨다. 이 때 예열이 끝나면 꺼내서 Inverting으로 빠르게 섞어주고, 첫 번째 실험과 다르게 tube의 캡을 닫아서 water bath에 넣어준다. 이후 각 tube에 1 M Na2CO3를 200ul씩 넣어 반응을 종결시킨다. 그 다음 각 sample당 Spectrophotometer를 이용해 Absorbance를 측정하고 기록한다. 이 때도 blank는 0분으로 설정해야 한다.Ⅳ. 결과 (Results)첫 번째 실험은 기질의 농도에 따른 효소 반응 속도를 확인하는 실험이었다. 결과를 표에 나타내면 다음 과 같다.OD420ONPG concentration100 uM250 uM500 uMTime0min0005min0.1490.1910.19310min0.2620.330.3515min0.3380.4770.504이를 그래프로 나타내면 와 같다.를 보면 기질의 농도 500 uM, 250 uM, 100 uM 순으로 시간에 따른 기울기가 크다.두 번째 실험은 온도에 따른 효소의 활성을 확인하는 실험이었다. 결과를 표에 나타내면 와 같다.온도(°C)흡광도40.069250.141370.345600.048900.035를 그래프로 나타내면 와 같다. 를 보면 약 37 °C까지는 흡광도가 점점 높아지고 약 37 °C에서 최대의 흡광도를 보인다. 하지만 37 °C를 넘어가면서 흡광도가 급격히 낮아지게 된다.세 번째 실험은 기질에 따른 효소의 반응 속도를 비교하는 실험에서는 몇 가지 오류가 발생했다. 첫 번째 오류는 시간이 일정한 간격을 두고 흐르면 흡광도의 값도 일정한 비율로 올라가야 하는데 꺾이는 점이 발생한 것이 첫 번째 문제이다. 두 번째 문제는 기질의 농도가 각각 100 uM, 250uM일 때와 비교해 250uM, 500uM일 때 흡광도의 차이가 거의 없었다는 점이다. 이러한 오류가 생긴 이유는 몇 가지 측면에서 볼 수 있다. 먼저, 실험과정에서 파이펫을 하지 않았다. 파이펫은 기질을 섞어 주는 역할을 하는데 파이펫을 하지 않았기 때문에 기질이 섞이지 않았고 이로 인해 오류가 발생했을 가능성이 있다. 두 번째 원인은 각 sample을 담은 tube에 있다. 이 실험에서는 단백질이 흡수한 빛의 양만을 측정해서 결과를 도출해 내야한다. 하지만 tube에 묻은 이물질이나 tube 자체의 문제 때문에 tube의 흡광도를 배제하지 못했을 수도 있다. 이런 이유 때문에 오류가 생겼을 가능성이 있다.두 번째 실험은 온도에 따른 흡광도를 측정하는 실험이었다. 실험 결과 37 °C까지는 흡광도가 점점 증가하다가 37 °C에서 최대 흡광도를 기록했다. 하지만 37 °C가 넘어가자 흡광도가 급격히 감소했다. 이는 효소가 단백질로 이루어져 있다는 것과 관련해 생각할 수 있다. 효소의 구조나 기능은 단백질의 3차원적 구조와 관련되어 있다. 단백질은 비가역적 성질을 갖고 있기 때문에 한 번 변성되면 구조가 바뀌기 때문에 단백질 고유의 기능을 상실하게 된다. 따라서 37 °C가 넘어가면 단백질의 구조가 변하게 되면서 빛을 흡수하는 기능을 상실했음을 알 수 있다. 37 °C인 이유는 체온이 37 °C인 것과도 연관지어 생각해 볼 수 있다. 37 °C인 체온에서 단백질이 가장 활발하게 작용하고 열이 나거나 체온이 37 °C이상으로 올라가면 단백질들이 파괴됨을 알 수 있다.세 번째 실험은 pH에 따른 흡광도를 측정하는 실험이었다. 실험 결과 온도와 비슷하게 pH 7.4 까지는 흡광도가 점점 높아지다가 .

자연과학| 2022.08.04| 11페이지| 1,500원| 조회(225)

실험, 생물, 생명과학, 1학년, 이과

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확산, 원형질 분리, 용혈현상

확산(Diffusion),원형질 분리(Plasmolysis), 용혈현상(Hemolysis)실험Ⅰ. 요약(Abstract)이 실험에서는 반투과성 막에 대해 알아보고 식물과 동물 세포에서 일어나는 확산, 원형질 분리, 용혈현상에 대해 알아보았다. 세포는 세포막을 통해 물질을 이동시킨다. 이 때 세포막은 특정 물질이 세포질로 출입할 수 있도록 물질의 출입을 조절하기 때문에 선택적 투과성(selective permeability)를 보인다고 할 수 있다. 물질이 세포막을 출입하는 방법은 능동수송과 수동수송으로 구분할 수 있다. 일단 능동수송은 물질의 농도 기울기와 관계없이 출입이 이루어지고, 에너지를 필요로 한다. 수동수송은 농도 기울기에 의해 일어나며 에너지를 요구하지 않는다.첫번째 실험에서는 삼투현상을 관찰했다. 먼저 dialysis membrane DIW에 넣어 activation시켰다. Activation 상태인 dialysis membrane을 0.1% Congo red mixture과 10%,20%,30% PEG를 이용하여 조립체를 만들었다. 조립체를 DIW에 넣고 60분동안 5분 간격으로 용액의 상승정도를 비교했다. 비교해보니 농도 30%, 20%, 10% PEG 순서대로 피펫에서의 상승정도가 컸다. 이 결과를 통해서 membrane을 통해서 DIW가 이동하고 PEG 농도가 클수록 DIW가 더 많이 이동함을 알 수 있었다.두 번째 실험은 원형질 분리를 관찰하는 실험이었다. 원형질 분리를 관찰하기 위해서는 식물세포를 이용해야 하므로 이 실험에서는 양파의 껍질세포를 이용했다. 양파의 껍질세포에 DIW(저장액), 0.9% NaCl(등장액), 10% NaCl(고장액)을 넣고 현미경을 이용하여 관찰하였다. 저장액 상태에서는 팽윤 상태, 등장액 상태에서는 정상이고 고장액 상태에서는 원형질 분리가 일어났음을 알 수 있었다.세 번째 실험에서는 용혈현상을 관찰하기 위해서 동물세포인 적혈구를 이용하여 실험을 했다. 실험과정은 두 번째 실험과 같았다. 하지만 세포벽의 유무 극성 물질과 약한 극성의 물질은 세포막을 통과한다. 세포막이 인지질 이중층으로 이루어진 것은 세포막이 선택적 투과성을 갖게 하는 원인 중 하나이다. 또한 세포막은 분자의 크기, 극성, 전하, 농도 기울기 등에 의해서도 물질의 출입을 조절한다.세포막을 통한 물질의 이동방법은 에너지 이용여부에 따라 능동수송과 수동수송으로 나뉜다. 능동수송은 인지질 이중층에 있는 운반체 단백질을 이용하여 에너지를 소비하면서 농도 기울기를 거슬러 저농도에서 고농도로 물질을 이동시키는 현상이다. 수동수송에 비해 부피가 큰 물질을 이동시킬 수 있다. 반면에 수동수송은 물질의 분포 차이에 의한 농도 기울기에 따라 물질이 이동하는 현상이다. 수동수송은 능동수송과 달리 에너지가 되지 않는다. 수동수송에는 확산과 삼투현상이 있다. 먼저 확산은 양쪽의 농도가 같아질 때까지 농도가 높은 쪽에서 낮은 쪽으로 물질이 이동하는 현상이다. 확산은 분자들이 운동하고 서로 부딪히면서 새로운 경로로 퍼져 나가기 때문에 일어나며 결과적으로 역동적 평형상태를 이룬다. 확산은 분자의 크기가 작을수록, 온도가 높을수록, 농도 차가 클수록 빠르게 일어난다. 확산에는 단순확산과 촉진확산의 두 가지 종류가 있다. 단순확산은 물질이 인지질 이중층을 직접 통과하여 이동하는 방식이다. 촉진확산은 물질이 인지질 2중층을 직접 통과하지 못하고 세포막에 있는 수송 단백질을 통해 이동하는 방식이다. 촉진확산에서는 물질의 농도 차가 어느 수준 이상이면 수송 단백질이 포화되기 때문에 촉진 확산 속도는 더 이상 증가하지 않고 일정하다. 촉진확산의 예로는 NA+-K+ 펌프 작용이 있다. 세포 안쪽이 바깥쪽에 비해 NA+ 농도가 낮더라도 운반 단백질에 NA+이 결합하고 ATP가 공급되어 분해되면 운반 단백질의 구조가 달라져 외부로 NA+가 방출된다. 동시에 외부의 K+이 변형된 운반 단백질에 결합한 후 인산기가 떨어지면 다시 원래대로 운반 단백질이 구조가 변하여 K+이 안쪽으로 들어온다. 다른 수동수송에는 삼투현상이 있다. 삼투현상은 반투과성피가 증가하게 된다. 이때 세포막이 견딜 수 있는 한계를 넘으면 세포가 터지게 되는데, 이와 같은 원리로 적혈구가 터지는 것을 용혈 현상이라고 한다. 동물세포를 고장액에 넣는 경우 동물세포는 쭈그러든다. 식물세포는 세포벽 때문에 동물세포와 다른 변화를 보인다. 식물세포를 저장액에 넣는 경우 동물 세포처럼 세포의 부피가 증가하게 된다. 하지만 세포벽이 있기 때문에 세포가 터지지 않고 팽윤상태가 된다. 식물세포를 고장액에 넣으면 유출되는 물의 양이 더 많기 때문에 세포막과 세포벽이 분리되는 원형질 분리가 일어나지만 세포의 모양은 유지한다.Fig 1. 물질의 농도 차에 따른 촉진 확산의 이동 속도Ⅲ. 실험재료 및 방법(Materials and Methods)첫 번째 실험은 삼투현상(osmosis)에 대해 알아보는 실험이다. 먼저 Dialysis membrane을 DIW에 activation 시킨다. Activation 상태인 membrane을 5mL pipette 입구에 parafilm을 사용해 연결시키며 연결부를 테이프를 이용해 단단히 봉한다. Tip의 끝에서부터 closure 사이의 거리가 2cm정도가 되도록 closure를 이용해 튜브를 밀봉한다. 완벽히 밀봉이 되어야 하므로 전동피펫을 이용해 밀봉이 잘 됐는지를 확인한다. PEG와 0.1% Congo red mixture를 피펫 위로 주입한다. 그 다음 DIW에 조립체를 넣고 60분 동안 5분간격으로 용액의 상승정도를 기록해야 한다. 이 때 PEG는 10%, 20%, 30%의 세 가지 농도를 가지고 실험을 해야 한다. 실험 과정에서 Congo red는 독성을 띄는 물질이기 때문에 전 실험과정에서 polygolve를 끼고 실험을 해야 한다.두 번째 실험은 식물세포에서 관찰할 수 있는 원형질분리와 관련된 실험이다. 먼저 식물세포를 얻기 위해서 양파 속껍질을 얇게 잘라 3조각 내서 슬라이드 위에 올려 놓는다. 양파 위에 DIW(저장액), 0.9% NaCl(등장액), 10% NaCl(고장액)을 각각 10ul씩 떨어뜨기다린 후 cover glass로 덮고 400배에서 관찰한다. 이 때 이쑤시개로 잘 섞은 후 얇게 펴주어야 적혈구를 관찰하기 쉽다. 세번째 실험의 경우 두번째 실험과 다르게 슬라이드를 그냥 버린다.Ⅳ. 결과(Results)첫 번째 실험에서는 삼투현상(osmosis)를 관찰하기 위해 5ml pipette tip에 10%, 20%, 30% PEG를 넣어주고 60분동안 5분간격으로 관찰했다. 그 결과를 표로 나타내면 Table 1과 같다.Table 1. 조립체의 PEG 농도에 따른 용액의 상승정도시간(분)*************5404550556010% PEG000.020.10.150.20.280.30.380.420.440.470.520% PEG00.150.350.420.790.840.931.051.11.181.251.31.3830% PEG00.30.50.81.051.31.581.721.92.12.3이를 그래프로 나타내면 Fig 2과 같다.Fig 2. 조립체의 PEG 농도에 따른 용액의 상승정도를 나타낸 꺾은선 그래프.Table 1과 Figure2을 통해서 60분동안 용액의 상승정도를 PEG 농도에 따라서 비교할 수 있다.두 번째 실험에서는 식물세포(양파의 껍질세포)의 원형질 분리현상을 관찰하기 위해서 양파의 세포에 DIW, 0.9% NaCl, 10% NaCl을 넣고 관찰했다. 관찰한 결과는 Fig3와 같다.Fig 3. 왼쪽부터 10% NaCl, 0.9% NaCl, DIW를 넣은 양파의 껍질 세포 (x100)세 번째 실험에서는 동물세포(적혈구)의 용혈현상을 관찰하기 위해서 DIW, 10% NaCl, 0.9% NaCl 위에 혈액을 떨어뜨리고 관찰했다. 관찰한 결과는 Fig4와 같다.Fig 4. 왼쪽부터 10% NaCl, DIW, 0.9% NaCl를 넣은 적혈구 (x400)Ⅴ. 논의(Discussion)첫 번째 실험에서는 조립체의 PEG 농도에 따라 용액이 상승하는 정도를 60분동안 5분 간격으로 관찰하고 각 농도별로 비교했다. 그 결과 10% PEG를 주입한 세포에서액의 농도 차이가 클수록 삼투현상이 더 잘 일어난다고 할 수 있다. 그리고 3개의 그래프를 비교했을 때 처음에 조립체를 만들 때 membrane 속으로 공기가 들어갔기 때문에 이것에 의해 오차가 발생했다고 볼 수 있다.두 번째 실험은 양파의 껍질세포를 이용해 식물세포에서의 원형질 분리 현상과 팽윤 현상을 관찰하는 실험이었다. 가장 왼쪽에 있는 그림이 양파 껍질세포를 고장액에 넣었을 때의 모습이다. 고장액에 넣게 되면 세포 내 수분이 고장액 쪽으로 빠져나가기 때문에 세포가 수축한다. 하지만 적혈구 세포와는 달리 세포벽이 있기 때문에 세포의 모양은 유지한 채 세포막이 세포벽과 분리되는 원형질 분리가 일어난 것을 관찰할 수 있다. 또한 세포벽 때문에 원형질 분리 상태의 식물 세포를 저장액에 넣으면 다시 수분이 들어와 원래의 상태로 돌아가는 원형질 복귀가 일어난다. 등장액에 넣으면 원래 세포의 모습과 비슷하다. 식물세포를 저장액에 넣으면 저장액의 물이 세포막 안으로 들어와 부피가 증가한 모습을 볼 수 있다. 하지만 식물은 세포벽이 있기 때문에 세포 모양을 유지하고 있는 것을 볼 수 있다. 일반적으로 살아 있는 식물세포는 주변보다 삼투압이 높기 때문에 주위로부터 물을 흡수한다. 이때 식물 세포의 부피가 증가하면서 세포벽이 세포로부터 받는 힘이 증가하는데, 이 힘을 팽압이라고 한다. 팽압이 최대가 될 때의 세포 상태를 팽윤이라고 한다. 이를 통해 식물 세포는 세포벽이 있기 때문에 갑작스러운 외부의 농도 변화가 있더라도 세포가 터지지 않고 세포 모양을 유지할 수 있음을 알게 되었다.세 번째 실험은 적혈구 세포를 이용해 동물세포에서의 삼투현상을 관찰하는 실험이었다. 동물세포는 식물세포와 달리 세포벽이 없기 때문에 외부 농도가 변할 경우 모양을 유지시켜 줄 세포 구조가 없다. 따라서 적혈구 세포를 고장액에 넣었을 경우에는 모양을 유지하지 못하고 찌그러져버린 모습을 볼 수 있다. 적혈구를 저장액에 넣었을 경우에는 세포막이 견딜 수 있는 한계를 넘을 정도의 물이 들어와 세포가 터학사

자연과학| 2022.08.04| 8페이지| 1,500원| 조회(288)

실험, 생물, 생명과학, 1학년, 이과

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사람의 유전(Genetics of Humans)

사람의 유전(Genetics of Humans)Ⅰ. 요약 (Abstract)이번 실험은 PTC를 이용한 미맹 여부와 ABO식 혈액형, Rh식 혈액형을 통해 사람의 유전 형질에 대해 알아보고 하디-바인베르크 법칙이 어떻게 성립하는지 알아보는 실험이었다.첫 번째 실험은 13단계로 희석된 농도의 PTC를 이용해 미맹여부를 판별하는 실험이었다. 미맹은 대립유전자가 모두 열성은 tt일 때 발현하고 유전자형에 우성이 하나라도 들어가 있으면 발현되지 않는 열성 형질이다. 이 실험을 위해서 가장 낮은 농도의 PTC부터 차례로 맛을 보아 처음으로 쓴 맛을 느낀 지점을 미각 역치로 잡았다. 그리고 모든 분반의 학생들의 데이터를 모아 antimode를 설정하고 그 이하는 미맹, 그 이상은 정상으로 설정했다. 그 후 하디-바인베르크 법칙을 이용해 대립유전자 T와 t의 빈도가 세대가 거듭되어도 변하지 않는다는 사실을 확인했다.두 번째 실험은 ABO식 혈액형과 Rh식 혈액형을 응집반응을 통해 알아보는 실험이었다. A형은 anti-α에만, B형은 anti-ß에만, AB형은 anti-α,ß 모두에 응집하고 O형은 응집반응을 나타내지 않는다. Rh식 혈액형은 응집을 하면 Rh+형이고 응집을 하지 않으면 Rh-형이다. ABO식 혈액형은 A,B가 공동우성이고 O가 열성을 띄기 때문에 4가지 표현형이 나오게 된다.Ⅱ. 서론 (Introduction)사람의 유전 연구는 완두나 초파리와는 달리 많은 어려움이 있다. 유전 연구를 위해서는 단시간 내에 여러 세대를 관찰할 수 있어야 하고 인위적인 교배가 가능해야 한다. 하지만 사람의 경우에는 한 세대가 매우 길며, 인위적으로 교배 실험을 하는 것이 불가능하다. 또한 형질이 유전자에 의해서만 결정되는 것이 아니라 주변 환경의 영향도 많이 받기 때문에 사람의 유전은 연구하기 쉽지 않다. 하지만 유전자 하나가 돌연변이 등으로 인해 바뀌게 되면 형질 발현에 큰 변화를 일으킬 수 있기 때문에 사람의 유전을 연구하는 것은 중요하다. 따라서 사람의 유전을 연구할 때등과 같은 간접적인 방법을 이용한다. 가계도 조사는 특정 유전 형질을 가지고 있는 가계에서 형질이 어떻게 유전되는지 알아보는 방법이다. 한 가계에서 자손의 수가 적을 때에는 집단조사의 방법을 이용한다. 집단 조사는 여러 가계를 포함하는 집단에서 얻은 자료를 통계 처리하여 유전 현상을 연구하는 방법이다. 쌍둥이 연구를 통해서는 환경이 형질에 미치는 영향을 알아볼 수 있다.이런 식으로 조사하는 사람의 유전 형질에는 보조개, 쌍꺼풀, 혀말기 등과 같이 대립 형질이 명확하게 구분되는 것도 있고, 대립 형질이 명확하지 않고 연속적인 변이를 나타내는 것도 있다. 이번 실험에서는 대립 형질이 명확한 미맹 여부와 혈액형에 대해서 조사해보았다. 미맹 여부는 PTC의 쓴 맛을 느끼냐 못 느끼냐의 여부에 따라 결정된다. PTC의 쓴 맛을 느끼는 사람은 미맹이 아닌것이고 PTC의 쓴 맛을 못 느끼는 사람은 미맹이다. 미맹 여부는 한 쌍의 대립유전자에 의해 결정되는데, 이 한 쌍이 둘 다 열성유전자(tt)인 경우에는 미맹이여서 쓴 맛을 느끼지 못하고, 우성 유전자가 하나라도 있는 경우(Tt, TT)인 경우에는 쓴 맛을 느낄 수 있다. 두 번째 형질은 혈액형이다. 사람의 혈액형에는 ABO 식 혈액형에는 A, B, AB, O 형의 4가지가 있고 Rh식 혈액형에는 Rh+ 형과 Rh-형의 2가지가 있다. 각 혈액형을 갖는 사람이 적혈구에 어떤 응집원을 갖고 혈장에 어떤 응집소를 갖는지는 의 내용과 같다.Blood typeABABO항원ABABNone항체ßαNoneα, ß이 때 ABO식 혈액형은 적혈구 막에 있는 응집원의 종류에 따라 구분된다. 각 사람의 ABO식 혈액형을 결정하는 방법은 각 혈액을 anti-A(α), anti-B(ß) 혈청에 넣어보는 것이다. A와 α, B와 ß은 항원-항체 반응에 의해 서로 응집하므로 anti-A에 응집하면 A형이나 AB형, anti-B에 응집하면 B형이나 AB형, 둘 다 응집하지 않으면 O형이다. 우열관계는 A, B 형은 공동우성이여서 우열이 없고 O형은 는 혈액형끼리는 원칙적으로는 수혈이 불가능하다. 따라서 같은 혈액형끼리는 수혈이 가능하지만 다른 혈핵형끼리는 수혈이 불가능하다. 하지만 소량 수혈의 경우에는 O형은 모두에게 줄 수 있고 AB형은 모두에게 수혈을 받을 수 있다. Rh식 혈액형은 붉은털 원숭이(Rhesus monkey)의 적혈구를 추출하여 토끼의 혈액 속에 주입하였을 때 생성된 Rh 항체를 이용한다. Rh식 혈액형의 구분은 와 같다.구분Rh+형Rh-형응집원있음없음응집소없음응집원에 노출되면 생성됨이 때 Rh식 혈액형도 동일한 혈액형끼리 수혈이 가능하며, Rh 응집원에 노출되지 않은 Rh-형은 Rh+형에게 수혈할 수 있다.집단 조사를 이용할 때 유전자의 빈도를 구할 때 하디-바인베르크의 법칙(Hardy-Weinberg Law)을 써서 구한다. 하디-바인베르크의 법칙은 다음과 같은 조건을 만족시키는 임의의 생물집단에서 성립한다. 첫 번째, 교배가 자유로이 이루어져야 한다. 두 번째, 집단의 크기가 아주 커야한다. 셋 번째, 집단 구성원의 이동이 없고 돌연변이가 없어야한다. 마지막으로 자연선택이 작용하지 않아야 한다. 이런 조건을 만족시키는 임의의 생물집단에서는 대립 유전자의 빈도는 세대를 거듭해도 일정하게 유지되며 평형상태를 유지한다.Ⅲ. 실험재료 및 방법 (Materials and Methods)첫 번째 실험은 PTC를 이용해 미맹 여부를 확인하는 실험이다. 먼저 이 실험은 PTC 원액 용액을 농도별로 13단계를 준비한다. 그 다음 낮은 농도부터 맛을 보게 하여 점점 희석이 되지 않은 농도의 PTC를 맛본다. 처음으로 쓴 맛이 났을 때가 그 사람의 미각 역치가 된다. 이 때 원액에서도 쓴 맛을 느끼지 못하면 미각 역치를 0으로 한다. 이 때 쓴 맛 이외에도 짠 맛이나 단 맛 등 다른 맛을 느껴도 맛을 느끼는 것으로 인정한다.두 번째 실험은 ABO식 혈액형을 판정하는 실험이다. 먼저 slide glass를 준비한다. 손을 70% EtOH로 소독하고 lancet을 이용하여 피를 내고 혈액을 slide gnti – A,B,D 위에 떨어뜨리고 응집여부를 확인해 혈액형을 판정한다.Ⅳ. 결과 (Results)첫 번째 실험은 미맹 여부와 어느 농도에서 역치 이상의 자극이 주어지는 지를 확인하는 실험이었다. 결과는 과 같다.이 그래프에 의하면 Antimode에 해당하는 값이 1이다. 따라서 미맹에 해당하는 사람은 미각 역치가 0,1 에 해당하는 사람들이며, 미맹이 아닌 사람들은 미각 역치 2~13 에 해당하는 사람들이다. 그러므로 미맹자는 30+7 = 37명이고, 미맹이 아닌 사람들은 144-37= 107명이다.미맹자(tt)의 빈도37명(총 144명) : 0.260.26=q2대립유전자 T와 t의 빈도q=0.51p+q=1 p=0.49T의 빈도 p : 0.49t의 빈도 q : 0.51유전자형 TT와 Tt의 빈도TT= p2 = 0.2401Tt = 2pq = 0.4998미각자 TT, Tt의 빈도P2 + 2pq = 0.7399따라서 하디-바인베르크 법칙에 의해 T의 빈도를 구하면, TT에서의 p2 과 Tt에서의 (1/2)(2pq)을 더하면 된다.즉, 0.2401+ (1/2)(0.4998) = 0.49가 나온다.따라서 세대를 거듭하더라도 하디-바인베르크 법칙을 만족시키는 임의의 생물집단에서는 유전자 빈도는 변하지 않는다.두 번째 실험은 ABO식 혈액형과 Rh식 혈액형을 판정하는 실험이었다. 실험 결과는 다음 , , , 와 같다. 그림에서 왼쪽부터 anti-α, anti-ß, anti-d이다. 이 그림들을 보면 4개의 혈액 모두 anti-d에서는 응집반응이 일어났음을 알 수 있고, A형은 anti-α에서만, B형은 anti-ß에서만, AB형은 anti-α, ß 모두에서 응집반응이 일어났고 O형은 응집반응이 일어나지 않았음을 알 수 있다.Ⅴ. 논의 (Discussion)미맹을 판단할 때 PTC의 맛을 느낄 수 있는지 여부에 따라 결정되었다. PTC가 왜 미맹을 판단할 수 있는지 알아보려면 PTC의 구조를 알아야한다. PTC의 구조는 과 같다.PTC 에는 쓴 맛을 내는 N-C=S 을 느낄 수 있게 된다. 따라서 쓴 맛을 느끼는 사람은 이 구조를 수용하는 화학물질이 있지만, 미맹자의 경우에는 수용하는 화학물질이 없어 쓴 맛을 느끼지 못한다고 판단할 수 있다. 하디-바인베르크 법칙에 의하면 이 미맹여부를 가르는 대립유전자 T와 t의 빈도는 세대를 거듭해도 일정하게 유지되어야 한다. 따라서 2015년에 측정한 결과와 2019년 현재에 측정한 결과는 똑같이 나와야한다. 2015년의 집단에서는 대립유전자 T의 빈도가 0.56이 나왔다. 하지만 2019년에는 0.49가 나왔다. 따라서 하디-바인베르크 법칙을 만족하지 않았다. 만족하지 않을것에는 몇 가지 이유가 있을 것이다. 먼저 집단의 수가 충분히 크지 않았다. 2015년과 2019년 각각 집단이 172명과 144명인데 지구의 전체 인구수인 70억명과 비교했을 때 하디-바인베르크 법칙이 만족하는지 여부를 따지기에는 집단의 크기가 너무 작았다. 그리고 쓴맛이라는 기준이 명확하지 않았다. 기계를 가지고 정확한 수치로 측정한 것이 아니라 감각에 의존했기 때문에 실제로는 역치 이상인데 쓴 맛을 느꼈다고 잘못 생각하거나 쓴 맛을 느끼지 않았는데도 쓴 맛을 느꼈다고 잘 못 생각했을 수도 있다. 그리고 커피를 많이 마시거나 담배를 많이 피는 등 외부적 요인이 작용했을 가능성도 있다.두 번째 실험은 혈액형을 판정하는 실험이었다. 혈액형 판정 실험에서는 A형은 anti-A, B형은 anti-B, AB형은 둘 다, 0형은 응집되지 않은 것을 확인할 수 있었다. 그리고 anti-D에는 모두 응집반응이 일어나 Rh+형임을 알 수 있었다. A형과 B형, AB형이 모두 있는 것으로 보아 A,B 사이에는 우열이 없고 공동우성임을 알 수 있다. 공동우성은 혈액형처럼 두 대립 유전자에 의한 형질이 동시에 나타나는 형질을 의미한다. 공동우성의 경우에는 소와 말의 털색이 갈색과 흰색의 혼합으로 나타난 것을 들 수 있다.Ⅵ. 참고 문헌 (References)Campbell, Biology: A Global Approach, 11t

자연과학| 2022.08.04| 10페이지| 1,500원| 조회(204)

실험, 생물, 생명과학, 1학년, 이과

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GFP 단백질과 단백질 정량(Protein Measurements)

GFP 단백질과단백질 정량(Protein Measurements)Ⅰ. 요약(Abstract)이번 실험은 Lowry assay와 Extinction coefficient assay 두 가지 방법을 이용하여 EGFP의 농도를 측정하는 실험이었다. Lowry assay는 Biuret reaction에 Folin reaction을 추가하여 Extinction coefficient assay 보다 단백질 검출 감도를 향상시킨 단백질 정량법이다. 몰리브덴과 텅스텐의 인산염을 포함하고 있는 Folin reagent 가 환원됨에 따라 나타나는 750nm의 흡광도를 측정하는 방법이다. 이 때 환원되는 Folin reagents의 양이 많을수록 진한 푸른색을 띠게 된다. Lowry assay는 biuret에 비해 sensitivity가 더 높기 때문에 감도가 더 좋다. 두 번째 방법은 Extinction coefficient assay이다. Extinction coefficient assay는 분광광도법과 시료의 몰흡광계수를 이용하여 용액의 단백질 구조를 직접 결정하는 방법이다. 특정 아미노산 흡광도를 이용하여 단백질 농도를 측정하는 방법과 특정 단백질의 3차구조를 이용하여 단백질 농도를 측정하는 방법이 있다.먼저 Extinction coefficient assay의 실험과정은 다음과 같다. 먼저 cuvette에 PBS 1ml를 넣고 spectrophotometer의 blank를 설정한다. 그 다음 다른 cuvette에 PBS 960ul와 EGFP 40ul를 넣고 pipetting으로 잘 섞어준다. 그 후 spectrophotometer를 이용하여 488nm에서의 흡광도를 측정하고 계산하면 된다. 두 번째로 진행한 실험인 Lowry assay는 6개의 well plate에 BSA의 농도가 0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08이 되도록 PBS와 BSA를 넣어준다. 그 후 solution A와 B를 각각 250ul과 2ml씩 넣어주고 750nm에서 흡광도를 측정한다. 그 쉽게 알 수 있다. 이 GFP를 돌연변이 시켜 만든 것이 EGFP이다. EGFP는 64번 Phenylalanine을 Leucine으로 바꾸고 65번 Serine을 Threonine으로 변형시킨 것이다. EGFP는 GFP보다 spectrophotometry에서 더욱 더 정밀한 측정이 가능하다.많은 생물학적 분자들은 빛을 흡수하는 성질을 가지고 있다. 따라서 빛을 흡수하는 정도도 단백질마다 다른데 이를 흡광도라고 한다. EGFP를 포함한 모든 단백질은 280nm에서 큰 흡광도를 보인다. 이는 aromatic amino acid인 Tryptophan, Tyrosine의 고리구조가 280nm에서 높은 흡광도를 가지기 때문이다. 하지만 EGFP는 특수한 3차 구조 때문에 488nm에서도 높은 흡광도를 보인다. 따라서 EGFP의 농도를 측정할 때 EGFP만 높은 흡광성을 보이는 파장인 488nm에서 재야 오차를 줄일 수 있다. 이 분광광도법을 하기 위해 사용하는 기구가 분광광도계이다. 분광광계도는 입사광과 투과광의 강도를 비교하여 흡광도를 결정하는 기구이다. 광원에서 나오는 빛은 혼합광이다. 이 빛은 단색화장치를 거치면서 단색광이 되면서 시료가 들어있는 cuvette으로 들어가게 된다. 이 때 들어가는 빛을 입사광으로 한다. 그리고 cuvette을 통과하여 나오는 빛을 투과광이라고 한다. 분광광계도는 이 두 값을 비교하여 흡광도를 계산한다. 이 때 흡광도를 결정하는 식을 다음과 같다.[A (absorbance, OD) = -Log(T)=-Log(I/I0) =Log(I0/I)](T=투과율, I0=입사광, I=투과광)특정파장에서의 용액 내 시료의 흡광도는 시료의 농도, 투과거리에 비례한다. 이 관계를 Lambert-Beer law 라고 한다. 이 때 투과거리는 특수한 경우가 아니면 투과거리는 1cm로 고정한다.[ A(OD)= ε c ℓ]A: 흡광도 (absorbance)ε : 몰흡광계수 (molar extinction coefficient, M-1cm-1)c : 용액 내 시한 단백질이나 peptide의 검출방법 중 하나이다. 이는 시료의 수용액에 NaOH 수용액을 가하고 이 혼합물에 CU2+를 첨가하면 청자색-적자색을 보이는 반응이다. 이는 CU2+이 단백질 내의 peptide bond의 질소 원자와 complex를 이루면서 이것이 흡광성을 나타낸다. 따라서 peptide bond가 많을수록 540nm 흡광도를 가지는 violet color가 강해진다. 하지만 sensitivity가 좋지 않아서 sample에서 peptide bond 가 있는지 여부를 확인할 때만 쓰인다. 따라서 sensitivity를 더 높이기 위해 Lowry assay를 만들었다. Lowry assay는 Biuret reaction에 의해 형성된 Cu2+-peptide bond의 Cu2+를 비롯한 단백질들이 산화되면서 Folin reagent가 환원되는 반응이다. 이 때 환원된 Folin reagents의 양이 많을수록 750nm 흡광도를 가지는 진한 파란색이 강해진다.Extinction coefficient assay를 통해서 단백질 정량 실험을 진행하면 Lambert-Beer Law와 이미 알려진 몰흡광계수를 이용하여 측정된 흡광도 값을 단백질 농도로 환산할 수 있었다. 하지만 Lowry assay는 몰흡광계수를 결정할 수 없다. 따라서 미리 농도를 알고 있는 단백질 시료에 대해 농도별 Lowry assay를 수행하여 표준곡선 식을 이끌어낸다. 그리고 알고 싶은 단백질에 대해 Lowry assay를 시행하면 흡광도 값을 단백질 농도 값으로 전환할 수 있다. 이 때 표준곡선을 구할 때 사용되는 단백질을 표준 단백질이라고 한다. 보통 일반적으로 BSA를 이용한다.단백질을 정량하는 방법은 위에서 살펴본 Lowry assay나 Extinction coefficient assay 외에도 Bradford나 BCA 등 여러가지 방법이 있다.Ⅲ. 실험재료 및 방법(Materials and Methods)이번 실험에서는 EFGP 정량을 위해 Lowry assay와 Extinction coefficient assay 방법을 이용하여 EGFP를 정량하는 방법이다.먼저 cuvette에 PBS 1ml를 넣고 spectrophotometer의 blank(영점)를 설정한다. 그 다음 다른 cuvette에 PBS 960ul와 EGFP 40ul를 넣고 pipetting으로 잘 섞어준다. 그 다음 Spectrophotometer를 이용하여 488nm에서의 흡광도를 측정한다. 그 후 미리 계산된 extinction coefficient를 이용하여 EGFP의 질량농도를 계산한다. 이 때 계산하는 방법은 다음과 같다.EGFP extinction coefficient=61000cm-1M-1EGFP MW=30.6kDa=30600g/mol 은 이미 알려져 있는 값들이고EGFP의 몰 농도는 (흡광도)/(extinction coefficient)/(cuvette length)*(dilution factor) 이고EGFP의 질량농도는 EGFP의 몰 농도(mol/L)*EGFP MW(g/mol) 로 계산하면 된다.Ⅳ. 결과(Results)Extinction coefficient assayEGFP의 몰농도(M) = (흡광도)/(Extinction coefficient assay)/(cuvette length)*(dilution factor)=(0.016)/ (61,000cm-1M-1)/ (1cm)* (1000μℓ/ 40μℓ)=0.0000066 M따라서 단백질의 몰농도는 0.0000066 M이 나왔다. 계산된 몰농도를 이용하여 질량농도를 계산하면 다음과 같다.EGFP의 질량농도=(EGFP의 몰농도) * (EGFP MW)=0.0000066mol/l * 30600g/mol=0.20196mg/ml이 때, 다음의 값들은 이미 알려져 있다고 한다.EGFP extinction coefficient(ε) = 61,000cm-1M-1EGFP MW = 30.6kDa = 30600g/molLowry assayBSA 농도 당 측정한 흡광도는 아래의 Table과 같다.BSA (mg/m/ml 만큼 나왔고 Lowry assay를 이용한 방법에서는 0.1600831601 mg/ml 만큼 나왔다. 다른 두 방법을 이용해 측정한 단백질양은 0.0418768399 mg/ml 만큼 차이가 나면서 같게 나오지 않았다. 따라서 오차가 생긴 이유를 생각해보았다.두 단백질의 농도가 다르게 나타난 원인은 여러가지가 있을 수 있다. 여러가지 원인 중 흡광도의 원인도 있다. 흡광도에 차이를 가져다준 것에는 몇 가지 원인이 있을 것이다. 먼저 호일로 덮어준 것을 생각할 수 있다. Lowry assay 에서는 Solution A, B를 넣어준 다음 호일로 덮는다. 이는 단백질의 변성을 막기 위해서라고 생각할 수 있다. Lowry assay를 이용한 방법에서는 Cu2+-peptide bond의 산화를 이용한다. 이 때 빛을 쐬어주면 열에 의해 peptide bond를 이루는 단백질들이 변성되면서 3차 구조가 변하게 된다. 따라서 이 때문에 흡광도가 다르게 나타났을 수 있다. 두 번째 원인은 용기에서 찾을 수 있다. 용기 자체의 흡광도도 있기 때문에 이를 배제하기 위해 석영이나 플라스틱으로 이루어진 용기를 쓴다. 하지만 실험하는 과정에서 용기에 이물질이 묻었을 수도 있다. 장갑을 꼈지만 장갑에 묻어있는 이물질이 용기에 묻었을 수도 있고 먼지가 붙어있을 수도 있다. 이런 경우에는 시료만의 흡광도를 완벽하게 측정할 수가 없기 때문에 오차가 생길 수 있다. 세 번째 원인은 pipetting 과정에서 찾을 수 있다. Pipetting을 하면 다시 빨아드리는 과정이 있는데 다시 빨아드리고 용기에 넣을 때 정확히 모든 양을 넣지 않았을 수 있다. 그리고 pipetting 과정에서 기포가 발생한 적이 있는데 이 기포 때문에 흡광도가 정확히 측정되지 않았을 수도 있다. 매우 소량의 양을 가지고 실험을 하기 때문에 이런 미세한 차이나 실수도 큰 오차를 유발한 원인이 될 수 있다.앞으로 이런 오차를 없애기 위해서는 더 조심하게 실험을 수행해야한다. 먼저 pipette으로 용액을 옮길 때 m

자연과학| 2022.08.04| 8페이지| 1,500원| 조회(307)

실험, 생물, 생명과학, 1학년, 이과

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