제한효소 절단 플라스미드 DNA을 이용해Ligation 반응물을 대장균 형질전환 후,α-complementation 과 Agarose gel Electrophoresis를 통해 DXS 삽입 여부 확인Using restriction enzyme digesting plasmid DNAafter the ligation reaction was transformed into E. coli,Confirmation of DXS insertionthrough α-complementation and Agarose gel electrophoresisJee-eun JeonKey Words: Gene cloning, Plasmid, DNA, DNA Purification, Ligation, Plasmid vector, pBS-SK(+), DXS, Competent cell, Transformation, Agarose Gel Electrophoresis, α-complementation, Blue/ White Colony,AbstractIn this experiment, DNA ligation was performed using pBS-SK (+) and DXS gene obtained from the electrophoresis experiment of the 3rd week, and the ligation reaction was introduced into E. coli. We then use α-complementation to determine the color of the selected colony to see if it has succeeded in recombination. Experiment with electrophoresis using colony to make sure DXS is properly inserted. PCR experiments were conducted only until setting. After the gel purification, the 진 점이 연결된다. 그리고 이 끊어진 점 사이에 새로운 유전자를 넣으면 재조합 DNA가 생기게 된다.세포를 둘러싸고 있는 외부 환경, 즉 배지에 존재하는 DNA가 세포 내부로 도입됨을 형질전환(transformation)이라 한다. 대장균의 유전 형질 전환에 Ca{} ^{2+}과 같은 2가 양이온을 이용하여 세포벽에 변화를 주어 외부 DNA가 세포 안으로 들어가게 한다. 세포가 외부 DNA를 받아들일 상태가 된 것을 ‘Competent cell’ 이라고 한다.유전자의 클로닝에 사용하는 플라스미드 벡터는 기본적으로 복제원점과 항생제 내성을 갖는 유전자를 가지고 있어야 한다. 항생제 내성 유전자는 그 플라스미드를 가지고 있는 대장균만을 선택적으로 배양하기 위해서 필요하다. 또한 원하는 유전자를 삽입하기 위해서 벡터 상에 여러 제한 효소의 인지서열이 필요한데, 일반적으로 플라스미드 벡터에는 Multi-Cloning site (MCS)이 존재해서 이 MCS에 다양한 제한효소의 인지서열들이 존재한다.이번 실험에서 사용한 플라스미드 벡터는 pBlueScript이다. 이 pBlueScript는 세포 내 개수가 많으며 MCS에 다양한 제한효소의 인지장소가 존재한다. 그리고 또 다른 장점은 적절한 숙주세포에서 α - 상보성이 가능하다는 점이다.α - 상보성 (α - complementation) 은 외부 DNA를 플라스미드 벡터에 클로닝하는 경우 외부 DNA가 삽입된 재조합 벡터 DNA의 정제 및 분석 이전에 우선 균체의 색으로 구분하는 방법이다.실험에서는 α - 상보성 원리가 일어났는지 여부를 발색 기질을 이용해 균체의 색으로 판단한다.lac Z에서 lactose를 분해하는 β-galactosidase를 분비하는데 재조합 되지 않은 pBS-SK(+)는 lac Z가 정상적으로 작용하고 재조합된 pBS-SK(+)-DXS는 lac Z가 손상되어 작용하지 않는다.X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactoside)은 Lactose의 유사체로 β-g에 담는다. Gel 조각 10mg 당 10μl의 ‘membrane binding solution’을 넣고 50~65℃에서 간간히 vortex를 하며 완전히 녹인다. 완전히 녹은 gel을 튜브에 삽입된 mini column에 옮기고 실온에서 1분간 방치한다. 최고속도에서 1분간 원심분리 하여 용출액을 제거한다. mini column 에 750 ul의 Wash 용액을 넣고 13000rpm, 1분간 원심분리 하여 세척하고 용출액을 제거한다. 같은 방식으로 500 ul의 Wash용액을 넣고 13000rpm, 5분간 원심분리 하여 세척하고 용출액을 제거한다. 원심분리기 뚜껑을 open한 상태로 mini column 을 13000rpm, 1분간 추가로 원심 분리하여 Wash 용액을 완전히 제거한다. mini column을 새로운 microcentrifuge tube에 옮기고 50ul의 Nuclease-free water를 첨가하고 1분간 실온에 방치한 후 13000rpm, 1분간 원심분리 하여 DNA를 용출한다.그리고 DXS 와 SK(+)가 제대로 분리되었는지 확인하기 위해 전기영동을 실시하였다.2.2 DNA Ligation위의 용출된 DNA를 이용해 세 가지의 ligation 반응을 setting 한다. 반응 1에는 pBS-SK(+) 2μl, ,DXS 6μl, Ligation Buffer 1μl, Ligase 1 μl을 넣는다. 반응 2에는 pBS-SK(+) 4μl, ,DXS 4μl, Ligation Buffer 1 μl, Ligase 1 μl을 넣는다. 반응 3에는 pBS-SK(+) 6μl, ,DXS 2μl, Ligation Buffer 1 μl, Ligase 1 μl을 넣는다. 넣을 때 pBS-SK(+)와 ,DXS 후에는 13000rpm, 1min 으로 spin down 시켜준다.모든 시료를 다 넣은 후 tapping 해주어 시료들을 모으고 다시 동일 조건으로 spin down 해준 다음 4℃에서 16시간 (overnight) 반응시킨 후 ?20℃에서 냉동보관 시킨Overnight 동안 반응을 시켜준 후 다음 날 아침 Colony 확인을 한다.2.5 Plasmid 분리Promega plasmid 분리 kit를 이용해 plasmid를 분리한다. IPTG/X-gal 배지에서 선발한 Blue/ White colonies를 실험 전 날 LB-Amp 액체배지에 접종하고 밤새 배양한다. Blue/ White 배양액 중 1ml을 각각 micro tube에 넣고 13000rpm, 1min 원심분리하여 세포를 침전시킨다. 그리고 상등액을 제거한 후, 침전된 세포를 250μl의 Cell resuspension solution 250μl에 현탁하고 vortex 해준다. 세포 현탁액이 들어있는 tube에 250μl의 Cell Lysis Solution을 넣어준 후에 5번 정도 천천히 뒤집어 섞어준다.Tube 안 배양액이 투명, 끈적해지는 것을 관찰하고 Alkaline Protease 용액 10μl를 넣고 실온에서 5분 동안 기다린다. 350μl의 Neutralization Solution을 넣고 천천히 5번 정도 섞어준다.하얀색 침전이 생기면 용액을 10분 동안 원심분리 해주고 plasmid를 포함하는 상층액을 침전물이 안 따라오게 mini column으로 조심스럽게 옮긴 후에 1분 동안 원심분리 하여 용출액을 제거한다.Mini column에 750μl의 wash용액을 넣고 1분동안 원심분리 해 세척하고 용출액을 제거해준다. 그 다음 250μl의 wash용액을 넣고 2분 간 원심분리를 마친 후에 mini column을 새로운 tube에 옮긴다.Mini column에 100μl의 Nuclease-free water를 첨가하고 1분 동안 원심분리 하여 DNA를 용출한다.2.6 제한효소 절단위의 실험에서 용출된 DNA의 시료를 이용해 제한효소반응을 준비한다. DNA 10μl, 10x Buffer H 2μl, BSA 2μl, DW 5.5μl씩 넣어준 후 13000rpm, 1분 동안 원심분리 한다. Tube 바닥에 시료들이 모이면 얼음상태에 보관해둔Cycle의 첫단계는 94°C에서 5분간, 두번째는 94°C에서 30초, 60°C에서 30초, 72°C 1분간 반응시켜주는데 두번째 과정을 30회 반복한다. 반복한 다음 72°C에서 10분간 반응시키면서 완전히 합성될 때까지 기다린다. 이과정이 끝나면 다음 실험을 할 때까지 4°C로 시료들을 유지해준다.그림 1. Gel Purification 후 전기영동 결과3. 결과3.1 DNA Gel Purification 후 전기영동3주차 전기영동 실험 결과를 이용해 실험을 진행했다. 실험 목적인 pGEM-T-Easy-DXS에서 분리한 DXS유전자와 절단된 pBS-SK(+)가 제대로 존재하는지, 그 양은 충분한지 확인하는 실험이다. 전기영동 분석결과 우리 조 결과인 그림 1의 lane 1인 DXS는 약 2000bp, lane 2인 절단된 pBS-SK(+)는 약 2900bp로 알맞은 위치에 있었다. 그리고 선명하게 밴드가 나타나 충분한 농도와 양의 DNA를 얻은 걸 알 수 있었다.3.2 대장균의 형질전환 후 colony 확인α-상보성의 원리가 일어났는지의 여부를 발색기질을 이용해 균체의 색으로 판단한다. 실험 목적인 재조합 유전자인 pBS-SK(+)-DXS는 lac Z가 손상되어 X-gal을 분해하지 못하므로 흰색을 나타낸다. 반면 재조합되지 않은 유전자 pBS-SK(+)는 lac Z가 정상적으로 작용해 X-gal을 분해해 파란색을 나타낸다.실험 결과 우리 조 결과는 pBS-SK(+)를 나타내는 Blue colony만이 나타났다. 다른 조들도 실패했지만 우리 반에서는 1조만 White colony가 조금 나타났고 이를 빌려 다음 실험을 진행하기로 하였다.3.3 선별 Colony 전기영동실험을 성공한 1조의 White colony를 이용했고 우리 조 실혐 결과인 Blue colony를 이용해 전기영동을 실시했다.그림 2의 Lane 1은 우리조가 실험한 실험으로 재조합 유전자인 pBS-SK(+)-DXS가 분리된 결과를 볼 수 있다. Lane 2 역시 우리 조가 실험한 실험으로 했다.
1. 자기소개 및 지원동기안녕하세요. ****학교이름 대학교에 지원한 (이름) 입니다.물리치료과를 지원한 이유는 몇 개월 전 회사에서 업무를 수행하다 발목인대파열 수술을 받게 되었고, 재활 과정을 겪으면서 물리치료, 그 중 도수물리치료에 관심이 생겨 지원하게 되었습니다. 저는 회복하기 위해..<중 략>2. 장점 및 단점 (특이사항이라 기관명 및 명칭 지웠습니다) 저의 장점은 책임감이 강하다는 점입니다. 저는 2019년 초에 ‘*****’ 에서 계약직으로 화학, 화공설비, 생물 분야에서 ****인지 판별하는 일을 했습니다. 처음에는 계약직이기 때문에 가볍게 지원했으나 ****의 위험성을 깨닫고 책임감을 느끼고 임하게 되었습니다. 연구원님들의 도움과 제 강점인 성실함과 꼼꼼함으로 관련 논문들과 사례들을 공부해가면서..<중 략>5. 학업계획.1학년 때는 학교 적응, 동기들과 친해지는 것, 다시 공부하는 습관을 세우는 것, 또한 아직 건강이 많이 회복되지 않았기 때문에 제 건강을 먼저 회복하는 것에 중점을 둘 예정입니다. 제 건강을 회복하는 것은 후의 환자들의 신뢰와도 연결이 되어있다고 생각하기 위해 필라테스와 홈트레이닝을 이용해 건강을 회복하기 위해 최선을 다할 예정입니다.
Plasmid DNA의 분리와 절단 실험 후Agarose gel Electrophoresis를 통해 DNA 확인이 름 (4조)After separation and cleavage of plasmid DNAIdentification of DNA by Agarose gel ElectrophoresisNameKey Words: Gene cloning, Plasmid, DNA, E. coli JM109 (w/ pGEM-T-Easy-DXS , w/ pBlueScript-SK(+) ), Agarose Gel ElectrophoresisAbstractGene cloning refers to the technique of combining certain genes from cells, or by combining certain genes created by gene recombination into a vector (carrier) of genetic material, and creating a uniform genetic group (clone). Plasmid DNA seperation and cleavage experiments were carried out using E. coli JM109 (w/ pGEM-T-Easy-DXS, w/pBlueScript-SK(+) ), and agarose gel electrophoresis was performed to confirm whether plasmid DNA isolation and cleavage were successful. As a result, there was a mistake, but Plasmid DNA seperation and cleavage experiments were well performed.1. 서 론생물공학 및 실습 수업시간에는 전체적으로 유전자 클로닝 (Gene cloning)을 진행한다. 그 중에 이번 보고서는 첫 번째 실험부터 세 번째 실험까지의 내용을 정리했는데, Plasmid DNA 분. 미생물 배양에 사용하는 배지에는 에너지 획득, 균체 물질의 합성과 대사산물의 합성에 필요한 모든 원소를 함유해야 한다. 모든 미생물은 물, 탄소원, 질소원, 무기물을 필요로 하며, 균주에 따라서는 특정의 아미노산, 핵산 또는 비타민이 요구된다. 그리고 호기성 미생물의 경우는 산소를 필요로 한다.플라스미드 (Plasmid) 는 세포내에서 세대를 통하여 안정하게 자손에게 유지, 전달됨에도 불구하고 염색체와는 별개로 존재하여 자율적으로 증식하는 유전자의 총칭을 말한다. 보통 세포의 생존에 있어서 반드시 필수적인 것은 아니지만 세균 세포에서는 접합전달(F인자), 항생물질 등에 대한 저항성(R인자), 항균물질(박테리오신)의 합성(콜리신인자) 등의 기능을 갖는다. 이번 유전자 클로닝에서는 벡터로 사용된다.플라스미드의 크기는 5~10kb, 염색체 DNA의 크기는 약 4800kb로 크기 차이가 많이 나기 때문에 이를 이용하여 분리한다. 가장 많이 이용하는 Alkaline lysis를 이용한 분리 방법이다. 첫 번째로 분리하고자 하는 플라스미드를 포함하고 있는 미생물을 배양하는 것이다. 하나의 클론을 이용하여 stationary phase에 다다를 때 까지 액체 배양을 실시한다. 두 번째로 배양배지로부터 박테리아를 분리한다. 분리하는 이유는 세포의 농도를 높이고, 플라스미드 분리를 촉진시키는 buffer 조건에 세포를 재현탁 시키는 것이다. 세 번째로 세포를 용해시키는데, 이 과정은 박테리아의 세포벽을 터뜨려 플라스미드 DNA를 방출하게 하는 과정이다. 보통 Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 와 NaOH가 혼합되어 있는 용액을 이용한다. SDS는 세포벽을 파괴시키고, NaOH는 cromosome DNA의 변성을 일으켜 매우 조심해서 다루어져야한다. 조심해서 다루지 않아 염색체의 DNA가 조각이 나면 크기 차이가 없어져 플라스미드 DNA와 조각난 염색체 DNA의 분리가 불가능 하게 된다. 세포가 용해되면 pH를 중성근처로 낮추기 위해 보통 acetate b 단편을 200bp에서 ~ 50kb까지 크기에 따라 분리할 수 있어 사용이 간편하고, 다루기가 쉽기 때문에 가장 많이 사용하고 있는 전기영동이다. 겔의 밀도는 아가로스의 농도(%)에 따라 정해진다. 이러한 겔에 전기장이 주어지면, 기본 골격에 있는 인산기에 의해 음전하를 띠는 DNA는 양극으로 이동한다. 이때 DNA가 이동하는 정도는 여러 요인이 있는데 기본적으로 분자량이 커질수록 늦어지고, 겔의 밀도, 즉 아가로스의 농도가 클수록 늦어진다. 또 DNA분자량이 같더라도 구조에 따라 움직이는 속도가 다르다. 예를 들면 꼬인 supercoiled DNA는 선형 DNA보다 빠르게 움직여 이동거리가 크다.표 1. Agarose Gel 농도에 따른 DNA 분리 범위(kb)Agarose Gel 농도 [% (w/v)DNA 분리 범위 (kb)0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-22. 실험2.1 배지의 제조와 대장균 접종Tryptone 1g, Yeast Extract 0.5g, NaCl 1g, Agar 1.5g을 삼각플라스크에 넣은 후, 증류수를 더하여 최종 부피 100ml을 맞춰준다. 그 다음 Autoclave 고압 증기 멸균기로 121℃, 1.5atm, 1hr로 멸균해주어 LB ( Luria ? Bertani ) Agarose 고체배지를 제조한다.Agar을 제외한 시료를 동일하게 유리시약병에 넣은 후, 증류수로 최종 부피 100ml을 맞춰준다. 동일한 조건으로 멸균해 LB ( Luria ? Bertani ) Broth 액체배지를 제조한다.고온증기 멸균된 고체배지, 액체배지를 찬물로 식힌 후 (50℃이하), 50mg/ml ampicillin 100μL를 첨가한다. Agarose Plate의 경우 ampicillin을 잘 섞은 후 무균 plate 에 멸균배지를 적당량(~20ml/plate) 부어 굳을 때 까지 기다린다. 배지가 굳은 후 미리 준비된 대장균 (E. coli JM109 (w/ pGEM?T- Easy- Dmp 액체배지의 배양액 중 1ml 각각 마이크로튜브에 넣어 세포를 침전시킨 후, 침전 된 세포에 250μL의 Cell Resuspension Solution를 주입해 voltexing 한다. 그리고 250μL의 Cell Lysis Solution을 더한 후 튜브를 천천히 뒤집어 섞는다. 그 다음 Alkaline Protease 용액 10μL을 넣고 실온에서 5분간 방치한다. 350μL Neutralization Solution을 넣고 천천히 섞은 후 10분간 실온에서 원심 분리한다. 상층액을 미니 컬럼으로 옮긴 후 원심 분리하여 용출액을 제거한다. 미니 컬럼에 250μL의 Wash용액을 넣고 2분간 원심분리 후 미니 컬럼을 새 튜브로 옮긴 후 100μL의 Nuclease-free water 첨가 후 1분간 원심 분리하여 DNA를 용출한다. DNA는 ?10℃에 보관한다.준비한 대장균( pGEM?T- Easy- DXS, pBS?SK(+) ) 의 제한효소 EcoRI를 절단하기 위해 DNA 10.0μL, 10X Buffer H 2.0μL, BSA(1μg/μl) 2.0μL, DW 5.5μL를 tube에 주입 후 원심 분리하여 모두 tube 바닥에 모은다. 그 후 EcoR I 0.5μL 주입 후 tapping으로 잘 섞은 후 다시 원심 분리한다. 37℃에서 1hr 반응 시킨 후 ?10℃에 보관한다.2.3 Agarose Gel Electrophoresis0.8% Agarose를 전자렌지로 가열하여 녹인 후, 온도가 ~60℃로 내려오면 Ecodye 5μl 첨가하고 잘 섞은 후 casting 한다. Gel이 굳을 동안 시료를 준비하는데 실험 2에서 진행한 시료를 각각 10μl씩 새로운 tube들에 옮기고 DNA loading dye를 2μl씩 각각 넣어준 후 잘 섞는다.Gel이 완성된 후 DNA size marker 6μl와 시료 10μl를 well에 loading하고 100V에서 전기영동을 수행한다. 전기영동을 마친 후, 자외선을 이용하는 gel 이미지 분석장치를 이용해 D고 그 중 2개는 제한효소 EcoRI 절단했다. 실험이 끝난 후 다음 실험을 위해 ?10℃에 보관했다.3.3 Agarose Gel Electrophoresis그림 3. 100bp plus DNA Ladder그림 4. Agarose Gel Electrophoresis 결과Lane 1은 DNA Size marker, Lane 2 는 pGEM?T- Easy- DXS, Lane 3은 제한효소 EcoRI로 인해 절단된 pGEM?T- Easy- DXS, Lane 4는 pBS?SK(+), Lane 5는 제한효소 EcoRI로 인해 절단된 pBS?SK(+) 이다.Size marker는 100bp plus DNA Ladder 로, 이를 이용해 시료들의 band를 확인하였다.pGEM-T-Easy-DXS에서 분리한 pGEM- T-Easy는 약 2900bp에서, DXS유전자는 약 2000bp에서 밴드를 확인할 수 있다. 그리고 절단된 pBS?SK(+)는 약 2000bp에서 밴드를 확인할 수 있다.4. 결론 및 고찰이번 실험은 플라스미드 DNA를 분리하고 절단해 이를 Agarose gel 전기영동을 통해 확인하는 실험이었다.실험은 3주에 걸쳐 진행 되었고, 1주차에는 배지를 만들어 대장균을 접종해 배양하였고, 2주차는 대장균의 플라스미드 DNA를 분리하고 제한효소를 이용해 절단하였고, 3주차에서 Agarose Gel 전기영동을 통해 분리 및 절단이 잘 이루어졌는지 확인하는 실험을 진행하였다.1주차에서 만든 대장균을 접종한 LB-Amp- Agarose 고체배지, LB-Amp 액체 배지를 이용해 진행하였다. 그리고 2개의 고체배지에 각각 대장균을 접종하였을 때 pGEM?T- Easy- DXS는 single colony가 잘 분리되었지만. pBS?SK(+) 경우 colony가 분리되는 것이 아닌 너무 뭉쳐있는 모습을 확인할 수 있다. pBS?SK(+)의 오차의 원인으로는 실험원이 streaking을 할 때 균을 많이 떠서 진행했을 경우, 실험하면서 진행할 때 멸균과 소독이 제대로 안되었을 다.
물리치료학개론 과제 [물리치료사 인터뷰] 1.인터뷰 대상자 : ~~~~병원 ~~~~~~ 물리치료사2.인터뷰 날짜 : 2021년 3월 25일 3.인터뷰 방식 : 도수치료 중 간단히 인터뷰 진행 후, 상세내용은 메일로 수신.4.첨부 : 인터뷰 당일 병원 영수증 및 치료 중 사진촬영 및 동영상 촬영# 참고 ~~~~병원 : http://www. ~~~~~~~.com/########## 본인과 물리치료사님이 모두 나오는 치료받는 사진 2장, 손만 나오는 사진한장도수치료 받았다는 병원 영수증 첨부 = 총4장 사진 올렸음.5.인터뷰 1)안녕하세요. ~~~~ 물리치료사님. 자기소개 부탁드립니다.안녕하세요. ~~~병원에서 재활-도수 치료실에서 근무하는 물리치료사 ~~~~~입니다. 현재 임상 7년차이고, 주로 비수술환자 및 수술환자 재활치료를 하고 있습니다. 도수치료 뿐 아니라 모달리티, 충격파, 도수 전체를 아우르는 치료를 하고 있지만, ~~~ 환자님이 경험했듯이 도수치료를 주주로 하고 있습니다. 각종 소도구를 이용한 치료와 집에서 맨몸 운동으로 재활을 할 수 있는 치료를 집중적으로 하고 있습니다.
Chromatography | 16.07.01 | 1 차 발표 | 한국산업기술대학교 Contents 1. Chromatography 정의 4. Chromatography 종류 5. GC 정의 + 원리 3. Chromatogram 6. GC 구성요소 7. GC 용도 2. Chromatography 원리 Ⅱ. Gas Chromatography Ⅰ. Chromatography 그림출처 : https://ko.wikipedia.org/wiki/%ED%81%AC%EB%A1%9C%EB%A7%88%ED%86%A0%EA%B7%B8%EB%9E%98%ED%94%BC Chromatography 정의 1. 다성분 혼합물 을 각 성분들의 성질 ( ex 크기 , 용해도 , 흡착성 , affinity) 의 차이를 이용해 고정상 (stationary phase) 과 이 동상 (mobile phase) 에 분배하여 각 성분을 분리하는 분석법 . Chromatography 원리 2. 1) 최소한 두 상 (Phase) 이 존재 2) 분리 되는 각 성분이 두 상에 대한 서로 다른 분포 (Distribution) or 분배 (Partition) 를 가져야함 기본조건 Chromatography 원리 2. 분배계수 (K) - 용질이 이동상과 고정상 사이에서 분배되는 정도의 차이 -