제한효소 절단 플라스미드 DNA을 이용해 Ligation 반응물을 대장균 형질전환 후, a-complementation 과 Agarose gel Electrophoresis를 통해 DXS 삽입 여부 확인

소개글

"제한효소 절단 플라스미드 DNA을 이용해 Ligation 반응물을 대장균 형질전환 후, a-complementation 과 Agarose gel Electrophoresis를 통해 DXS 삽입 여부 확인"에 대한 내용입니다.

목차

1. 서 론

2. 실험
2.1 DNA Gel Purification
2.2 DNA Ligation
2.3 LB-Amp-IPTG-X-Gal 평판 배지 제조
2.4 대장균의 형질 전환
2.5 Plasmid 분리
2.6 제한효소 절단
2.7 Agarose Gel Electrophoresis
2.8 PCR

3. 결과
3.1 DNA Gel Purification 후 전기영동
3.2 대장균의 형질전환 후 colony 확인
3.3 선별 Colony 전기영동
3.4 PCR setting

4. 결론 및 고찰

본문내용

유전자를 Cloning하기 위해서는 목적하는 DNA를 자기증식이 가능한 vector에 삽입하고 연결해야 할 필요가 있다. 삽입된 유전자는 플라스미드가 복제될 때 함께 복제되며 세포 내에 일정 수 존재하는 재조합된 플라스미드 벡터를 분리함으로써 원하는 유전자를 보존하고 유지할 수 있다. 이와 같이 유전자는 다양한 벡터에 삽입하여 염기서열의 결정, 돌연변이의 도입, 대장균 내에서의 단백질 과량발현 등 여러 조작이 가능하게 한다.

DNA의 염기서열 분석을 하려면 DNA를 정제 (Purification) 해주어야 한다. Gel에서 DNA가 있는 부분을 오려낸 후 spin column을 사용하여 buffer 및 agarose gel 및 그 이외의 불순물을 제거하여 정제하는 것이다.
DNA를 제한효소로 절단하고, DNA ligase를 작용시키면 끊어진 점이 연결된다. 그리고 이 끊어진 점 사이에 새로운 유전자를 넣으면 재조합 DNA가 생기게 된다.
세포를 둘러싸고 있는 외부 환경, 즉 배지에 존재하는 DNA가 세포 내부로 도입됨을 형질전환(transformation)이라 한다. 대장균의 유전 형질 전환에 Ca과 같은 2가 양이온을 이용하여 세포벽에 변화를 주어 외부 DNA가 세포 안으로 들어가게 한다. 세포가 외부 DNA를 받아들일 상태가 된 것을 ‘Competent cell’ 이라고 한다.

유전자의 클로닝에 사용하는 플라스미드 벡터는 기본적으로 복제원점과 항생제 내성을 갖는 유전자를 가지고 있어야 한다. 항생제 내성 유전자는 그 플라스미드를 가지고 있는 대장균만을 선택적으로 배양하기 위해서 필요하다. 또한 원하는 유전자를 삽입하기 위해서 벡터 상에 여러 제한 효소의 인지서열이 필요한데, 일반적으로 플라스미드 벡터에는 Multi-Cloning site (MCS)이 존재해서 이 MCS에 다양한 제한효소의 인지서열들이 존재한다.

참고 자료

한국생화학회, 실험 생화학 개정 3판, 탐구당(2007), p. 329 - p.342
Takeshi Uozumi, 유전공학개론, 김재호,장혜영 공역, 청문사 (2001), p.47 – p.56,
네이버 지식백과, “PCR”, http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=2694811&cid=42411&categoryId=42411, (2017.05.30.)