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the great plate count anomaly 미생물 실험

The great plate count anomaly1. 실험 이론1) 미생물이란미생물은 일반적으로 맨눈으로는 관찰할 수 없는 작은 생물이다. 미생물의 micro-는 그리스어로 작다는 의미다. 미생물은 진균, 원생동물, 세균, 고세균, 바이러스, 조류 등을 포함한다. 지구상 어디에서나 살고 있고 어떤 미생물은 고등 생물이 도저히 살 수 없는 산소가 없는 환경, 100기압의 바다 밑 등 극한 환경에서도 활발히 활동한다. 미생물은 생태계의 분해자로서 영양분 재활용에 아주 절대적이다.2) 미생물의 생장측정미생물 세포는 육안으로 관찰되지 않기 때문에 시료 내에 얼마나 많은 미생물이 존재하는지 파악하기 위해서는 현미경으로 관찰하는 직접법 외에도, 생균수를 측정하는 방법, 세포의 농도를 측정하는 방법(탁도 측정, optical density, OD), 세포 구성물질(단백질 또는 핵산)의 양을 측정하는 방법, 세포의 건조증량을 측정하는 등의 간접법이 있다. 그중 평판계수법은 생균수를 측정하는 방법으로 고체배지에 미생물을 키워서 형성되는 집락의 수를 세는 방법이다. 단일 세포의 미생물은 최적의 조건에서 일정 시간마다 2배로 세포 수가 증가한다. 이론적으로 대장균(Escherichia coli)은 37℃에서 매 20분마다 두 배로 세포수가 증가하므로 10시간 배양 시 하나의 세포가 약 10억 개의 세포로 증가할 수 있으며 하나의 집락으로 자라게 되어 육안으로 관찰이 가능하다. 따라서 집락 수가 최초 시료의 생균수가 되며 이 숫자를 colony forming unit (CFU)이라고 한다. 콜로니가 겹치지 않도록 계수하려면 희석해야 한다.(serial dilution) 희석을 통해 cfus의 단위를 30~300개가 되도록 한다. 만약 cfus가 300을 초가하면 평판에서의 과밀로 일부세포들의 생장이 억제되었을 가능성이 있다. 30이하는 시료오차와 수의 과소평가일 수 있다.(CFU/ml)=성장한 미생물 집락의 수x 1/희석배수x1/접종량(ml)3) 평판계수법시료의 생균수 측정법으로서 고체배지에 미생물을 배양한 다음 생성되는 집락(colony)의 수를 세는 방법이다. 고체배지 표면에 미생물을 도말한 다음 배양하는 도말평판법(spread plate method)과 미생물을 포함하는 고체배지를 부어서 배양하는 주입평판법(pour plate method) 방법이 있다.① 도말평판법: 적절히 희석된 시료를 한천배지에 도말하여 배양하였을 때 자란 집락의 수를 세는 방법이다. 다양한 생육온도를 가지는 미생물 생균수의 측정에 사용가능하지만 특히 한천배지가 굳기 시작하는 온도(40℃) 보다 높은 온도에서는 생존에 영향을 받는 균주들은 주입평판법보다는 도말평판법을 사용하는 것이 좋다.② 주입평판법: 적절히 희석한 시료를 45℃ 정도의 한천배지와 잘 섞어서 plate에 부은 후 배양을 하는 방법으로서 한천배지가 굳기 전에 시료와 골고루 섞이도록 주의하여야 한다. 하나의 plate에 부을 수 있는 배지의 양(20 ml 내외)을 분주하여 멸균한 다음 45℃에서 보관하여 두고 시료를 섞기 전 꺼내서 사용하면 된다. 배양 후 집락의 수를 측정하는 방법은 도말평판법과 동일하다. 이 방법을 사용할 경우 호기성 미생물은 배지 표면에서는 잘 자라지만 배지 아랫쪽에서는 늦게 자라기 때문에 집락의 크기에 차이가 생길 수 있으며 미호기성의 미생물은 오히려 배지 아래쪽에서 더 잘 자라기도 한다. 액체 시료 또는 미생물 배양액이 고체 배지와 함께 섞여서 접종되기 때문에 고체배지의 표면뿐만 아니라 배지의 내부에서도 미생물 집락이 형성된다.(도말평판법과의 차이점)※평판계수법으로 측정이 어려운 미생물: 균사체를 형성하는 곰팡이나 방선균, 단일세포단위로 분리가 어려운 미생물이나 운동성이 높은 세균 등은 단일 집락을 형성하기 어려워 평판계수법으로 생균수를 측정하는데 어려움이 있다. 그러나 포자를 형성하는 곰팡이의 포자는 관찰 시기를 조절하면 측정이 가능할 수 있다.4) 직접계수법(Direct cell count)계수판을 이용한 방법이 간단하지만 작은 세균을 명시야 현미경으로 구분하고 계수하기는 어렵다. 이를 개선한 방법이 형광현미경(florescent microscoope)을 이용하는 직접 계수이다.① DAPI staining: 먼저 시료에 acridine orange, 4,6-diamino-2-phenylindole(DAPI), fluorescein isothicyanate 등의 형광 염료를 첨가하여 미생물 세포를 염색하고 black polycarbonate 재질의 nuclepor 여과막으로 여과 후 계수한다. 형광 현미경법에서는 광원으로 자외선을 이용하여 어두운 배경에서 형광 염색된 미생물 세포가 보이기 때문에 다른 유,무기물과 구분이 되어 보다 정확하게 계수할 수 있다. 그러나 형광을 내는 광합성 색소나 광물들이 있기 때문에 이것과 구분이 어려울 수 있다. 형광현미경 화상분석 프로그램이 있으면 자동으로 세포전체 계수뿐만 아니라 세포 형태별이나 부피나 사상체의 길이 계산 등도 가능하다.② 세포 계수기 이용법, Flow cytometry machine (GUAVA)유동세포 계수법은 유세포 분석기에서 형광으로 표지된 세포 (SYBR Green: dna 염색)가 검출기의 레이저 빔을 통과할 때 전방과 90도 각도로 산란되는 빛의 양을 측정해서 입자의 크기와 내부의 복잡성을 측정하며, 입자에 의해 방출되는 형광도 측정한다. 빛 에너지로 회수된 자료들이 전기 에너지로 전환되고 도수분포도로 그려진다. 유세포분석기의 세포 분리기는 입자의 전하를 달리하게 하며 복잡한 시료에서 원하는 세포나 입자들을 분리하여 계수할 수 있으며 추가적인 분석도 가능하다.5) 배양배지 culture media① 복합배지와 제한배지: 인공적인 생장배지상에서의 미생물의 배양은 생장을 위해 필요한 모든 영양과 에너지 요구성분을 배지가 공급하도록 요구한다. 그러나 몇가지 경우에는 어떤 생물의 생장을 위한 독립영양요구성분이 무엇인지 모를 때가 있다. 이러한 생물을 배양하기 위하여 육류나 식물체 추출물등을 사용하는 배지를 사용하는데 이것은 이들이 모두 아미노산, 뉴클레오타이드 염기, 비타민, 그리고 생장인자 등을 공급해주기 때문이다. 이러한 배지는 복합배지라고 불리는데 그 이유는 추출물 성분, 각각의 아미노산, 비타민, 생장인자의 양, 배지를 이루는 다른 성분이 확실히 알려져 있지 않기 때문이다. 제한배지는 특정화학성분이 알려져 있어 개별 배지성분의 무게를 정확히 달아 만든다.② 분별배지와 선택배지: 배지는 어떤 세균이 자라는 것을 허락하고 또 다른 세균의 생장은 억제하는 성분으로 만들어질 수 있다. 이러한 배지는 선택배지이다. 분별배지는 한 세균이 다른 세균과 구별되는 모양을 갖도록 하는 물질을 함유한다.③ 액체, 고체 배지: 배지는 어디에 사용하는가에 따라 액체 또는 고체배지로 준비된다. 액체 배양액 배양은 세균을 거대 용량으로 생장시킬 때 사용된다. 해초로부터 분리된 복합 다당체인 한천(agar)은 액체배지를 경화시키기 위해 1.5%의 농도로 첨가된다.※Incubator에서 배양 시, 고체배지 plate를 뒤집어서 보관하는 이유: 고체배지는 다량의 수분을 포함하고 있다. 뒤집어서 보관하지 않으면 plate dish 뚜껑에 습기가 차게 되면서 공기 중의 미생물에 의한 오염 확률이 높아질 뿐만 아니라 습기로 인해 물방울이 떨어지면 콜로니의 배양과 관찰에 영향을 줄 수 있다. 또한 배지 내의 수분손실 가능성도 증가하기 때문에 뒤집어서 보관한다.④ 배지 멸균: 어떤 배지라도 세균이나 다른 미생물이 생장하기 전에 멸균되어야 한다. 즉, 배지를 준비하는 동안 도입된 어떠한 오염 세균을 제거해야 한다. 대부분의 배지는 멸균한다. 이것은 121도에서 적어도 15분, 15psi압력으로 열을 가하는 것이다. 이러한 조건은 세포와 존재하는 내생포자를 죽이는데 충분하다. 때로는 열에 약한 성분이 있어 멸균 온도로 취해져서는 안된다. 이러한 성분은 0.45람다의 세균용 여과지에 통과시켜 무균 상태로 만든다.6) 미생물 배양 시 발생 가능한 오염의 원인: ①37도 water bath의 물: 개방된 채로 사용시 medium 표면이 미생물로 오염되었을 가능성 존재 ②손의 오염 ③실험 중 외부에서 반입되는 기구 ④clean bench 뒤를 사람이 오고 다닐 때 일어나는 바람 ⑤clean bench 내의 기구배치 ⑥배지가 묻은 dish의 뚜껑2. Discussion1) direct cell count가 heterophic plate count의 수보다 많은 이유는 무엇인가?직접 계수법은 현미경 시야나 계수기에서 세포로 간주되는 모든 것을 계수하기 때문에 생균 계수보다 훨씬 많은 수십 배 내지는 수천배 이상의 개체 수 결과가 나올 수 있다. 그러나 이 중에는 세포가 아닌 유. 무기물 입자와 죽은 세포도 포함될 수 있기 때문에 이런 종류의 비율이 높은 시료에서는 그 차이가 더욱 많이 나게 된다. 또한 미생물 활성에 영향을 미치지 못하는 휴지기 세포와 손상된 세포도 동시에 계수되어 그 영향에 대한 예측을 왜곡시킬 수 있다.

자연과학| 2021.05.18| 3페이지| 1,500원| 조회(458)

미생물, 주입평판, 미생물학실험, count, 도말평판

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