지식이힘이다 스토어

지식이힘이다

개인인증

팔로워0 팔로우

소개

리포트, 공모전 자료 등을 정리해서 제공해드립니다.

전문분야 공학/기술

판매자 정보

학교정보

입력된 정보가 없습니다.

직장정보

입력된 정보가 없습니다.

자격증

데이터 분석 준전문가 (한국데이터산업진흥원)
지식재산능력시험 3급 (한국발명진흥회)
컴퓨터활용능력 2급 (대한상공회의소)

판매지수

판매중 자료수

5개
전체 판매량

120개
최근 3개월 판매량

0개
자료후기 점수

-
자료문의 응답률

-

전체자료 5개

미생물 항생제 감수성 시험(S.aureus, E.coli, disk diffusion assay)

◆ Date : 2021 / 06 / 01◆ Group : 연구조◆ Title : 항생제 감수성 실험◆ Introduction : 1. 항생제와 내성 기작2. Minimum Inhibitory Concentration3. Disk diffusion assay① 항생제와 내성 기작ⓐ 항생제(Antibiotic)- 박테리아를 죽이거나 번식을 억제해서 항균작용을 보이며 감염을 치료에 사용된다.- 주로 특정 박테리아 또는 곰팡이에 의해 자연적으로 생성된다.- 박테리아의 대사 및 생존에 필수적인 분자과정 또는 합성 과정을 표적으로 하여 박테리아를 죽이거나 성장을 억제한다.- Quinolone계 항생제는 박테리아의 DNA 합성을 억제하며 그람 양성균과 음성균 모두에게 적용할 수 있다.- Rifampin 항생제는 박테리아 세포 내의 DNA 의존성 RNA polymerase를 막고 지방 친화적인 항생제이다.- Streptopmycin 항생제는 박테리아의 단백질 합성을 억제하는데 박테리아의 리보솜을 잘못된 mRNA로 유도하여 세균의 성장을 막는다.- Penicillin 항생제는 세균 세포벽인 펩티도글리칸의 교차연결 배열을 망가뜨리는데, 페니실린은 펩티도글리칸 분자를 연결하는 transpeptidase와 임의로 결합하고 이것이 세포벽의 약화를 유도한다. 이렇게 세포벽이 약해지면 삼투압 변화를 이기지 못하고 세포벽이 터져 죽는다.ⓑ 항생제 내성 기작- 자발적으로 돌연변이를 유도해 항생제가 DNA, RNA와 같은 유전물질이나 단백질에 작용하는 것을 차단한다.- 세포 내로 들어온 항생물질을 변형시키거나 붕괴시켜서 활성을 잃게 만든다.- 세포 내로 들어온 항생물질을 대사작용으로 그대로 바깥으로 내보낸다.- 항생물질로 인해 물질대사 경로가 막히거나 끊어졌을 때 다른 대사 경로를 이용해서 우회한다.② Minimum Inhibitory Concentration- 약자로 MIC. 최소 억제농도를 의미하며 이는 제약 과정에서 항균력을 측정하는 기초적인 지표이다.- 미생물의 번식을 억제할 수 있는 항생제의 최저 농도로 정의한다.- 미생물의 감수성 결과를 정확히 얻을 수 있다.- 액체배지 희석법은 시험관에 담긴 배지의 단계적 희석을 통해 MIC를 측정하기 위한 수단이다.- E-test(Epsilometer-test)는 플라스틱 스트립에 미리 정의된 항균물질 농도의 구배로 구성되며 항생제 등의 최소 억제 농도를 결정하는데 사용된다.③ Disk diffusion assay- 디스크 확산법은 박테리아의 항균물질 감수성을 측정하는 방법이다.- 항균물질이 포함된 디스크를 배지에 올리면, 디스크의 주변으로 항균물질이 농도 기울기를 형성하며 확산한다.- 박테리아는 항균물질에 의해 감수성을 가지면, 항균물질 성분이 특정 농도 이상인 부분에서 박테리아의 생장이 억제되고 고리 모양의 억제 영역을 관찰할 수 있다.- 상대적으로 적은 비용으로 여러 종류의 항균물질에 대한 세균의 감수성을 확인할 수 있다.◆ Materials : 실험 준비물- 고체 배지 2개, Vancomycin, Colistin Sulfate(CS), Staphlylococcus aureus 액체 배지, E. coli 액체 배지, 면봉, 후크형 핀셋, 네임펜, 라텍스 장갑, 에탄올◆ Methods : 실험 과정- 실험 전 멸균을 확실히 했다.① 고체 배지 2개를 준비했다.② 각 고체 배지의 바닥 면에 두 항생물질을 배치할 공간을 반으로 나누어 라벨링 했다.③ E.coli와 S.aureus를 면봉을 이용해서 각 배지의 전체 면에 접종했다. 이때 4회에 걸쳐 접촉하여 접종하는데 이는 lawn한 상태로 깔아주어 배지의 바닥에 골고루 접종하기 위함이었다.④ E.coli와 S.aureus를 접종한 배지 위에 ② 과정에서 표기한 대로 반쪽에는 Vancomycin을, 다른 반쪽에는 CS를 후크형 핀셋으로 하나씩 올려주었다. 이때 각 항생물질을 올리는데 서로 다른 후크형 핀셋을 사용하여 항생효과에 대한 오차를 줄였다.⑤ 뚜껑을 덮고 24시간 보존했다.◆ Result : 실험 결과- 실험 전 S.aureus는 그람 양성균이며, E.coli는 그람 음성균이라는 사실을 알고 있었다. 이 실험을 통해 어떤 항생제가 양성균 또는 음성균에 작용하는지 확인할 수 있었다.- 사진의 위는 표기한 대로 E.coli에 Vancomycin과 CS를 적용한 것이고 사진의 아래는 S.aureus에 Vancomycin과 CS를 적용한 것이었다. 항생제가 디스크 모양의 세균 억제 구역을 만든 것에 따라 Vancomycin은 그람 양성균(S.aureus)에, CS는 그람 음성균(E.coli)에 항생효과를 보인다는 것을 확인했다.◆ Discussion : 실험 후 고찰① 항생제 내성균과 그 특성ⓐ 메티실린 내성 포도상구균- 인체에서 장염, 폐렴 등을 일으키는 황색 포도상구균 중 베타-락탐계 (β-lactams) 항생제인 메티실린에 내성을 보이는 황색 포도상구균을 가리킨다.- 메티실린 내성 포도상구균은 메티실린 항생제가 부착하기 어려운 형태의 transpeptidase인 PBP2a를 보유하고 있다.- 메티실린 내성 포도상구균은 이 PBP2a 발현 유전자를 자른 포도상구균으로부터 수평적 유전자 이동(horizontal gene transfer)을 통해 전달받는다.ⓑ 반코마이신 내성 장알균- 요로감염, 균혈증 등을 일으키는 장알균(enterococcus) 중 반코마이신에 내성인 세균을 지칭한다.- 반코마이신 감수성 장알균이 반코마이신 내성 세균으로부터 반코마이신에 내성을 보이는 유전자를 받으면 내성 장알균이 된다.- 반코마이신 내성 장알균은 항생제 감수성 검사에서 페니실린, 암피실린, 퀴놀론, 마크로라이드와 같은 다양한 항생제에도 내성을 보이기 때문에 다제내성 세균으로 분류된다.② 베타-락탐계(β-lactams) 항생제 기작과 그 내성기작- 베타-락탐(β-lactams) 항생제는 페니실린과 같이 세균의 세포벽을 구성하는 펩티도글리칸의 생합성을 억제하는 항생제이다.- 베타-락탐 항생제는 펩티도글리칸 사슬이 교차결합하는데 관여하는 효소인 PBP(penicillin-binding protein)의 활성부위에 있는 serine 아미노산에 결합하여 이 효소의 활성을 억제함으로써 작용한다.- 베타-락탐 분해 효소(β-lactamases)는 세균이 베타-락탐 항생제에 저항하기 위해 생산하는 효소이다. 베타-락탐 분해 효소는 베타-락탐계 항생제에 공통으로 존재하는 베타-락탐 환을 가수분해한다.

자연과학| 2022.01.09| 6페이지| 1,500원| 조회(719)

항생제, E.coli, 대장균, 항생제감수성, s.aureus, 항생제내성, 반코마..

미리보기

닫기
PCR, 전기영동과 미생물 동정

◆ Date : 2021 / 05 / 18◆ Group : 연구조◆ Title : 미생물 동정◆ Introduction : 미생물 동정과 Phylogeny, PCR① 미생물 동정- 미지의 미생물이 분류체계에서 어디에 위치하는지 규명하는 것이 동정의 핵심이다. 보통 고전적 방법으로 형태적, 배양적 특성을 가지고 동정할 수 있고, 최종적으로 종(species)을 규명하기 위해서는 생리 생화학적 및 유전적 분석이 필요하다.ⓐ 미생물 동정 방법 ? 형태학적 방법- colony 형태, 운동성, 편모 여부, 세포 형태 등 고전적 관찰 방법이다.- 그람 염색도 이 방법에 포함된다.ⓑ 미생물 동정 방법 ? 생리학적, 생화학적 방법- 효소 활성도와 어떤 탄소원을 이용하는지, 대사 부산물을 생성하는지 등 미생물마다 다른 생리학적 대사에 따른 동정 방법이다.ⓒ 미생물 동정 방법 ? 유전학적 방법- 1차로 분류된 미생물에 따라 16S rRNA, 18S rRNA, ITS region의 염기서열을 분석하는데 대체로 16S rRNA를 많이 사용한다.- 16S rRNA는 리보솜의 구성성분으로 모든 박테리아가 가지고 있는 분자이며 박테리아 종마다 이 유전자의 염기서열이 다르기 때문에 이를 비교한 방법이 많이 이용된다.② Phylogeny와 Phylogenetic tree란?- Phylogeny는‘계통’으로서, 생물의 진화 역사를 보여준다. 미생물의 동정과 연관지어, 계통학적 방법은 흔히 16S rRNA를 이용한 분석을 따른다.- Phylogenetic tree는 생물의 진화 역사를 나타낸 표 형식의 그림으로 특히 박테리아에서는 16S rRNA sequence 분석을 사용하여 나타낸다.- 16S rRNA를 사용하여 Phylogenetic tree를 그리는 것은 한 가지 중요한 역할을 했는데, 바로 배양을 하기 힘든 미생물을 분석할 수 있게 했다는 것이다. 많은 미생물은 실험실에서 배양이 되지 않아 그 계통의 분석에 한계가 있었으나 유전자를 사용한 분석법을 통해 이를 극복했다.③ PCR이란?- Polymerase Chain Reaction(PCR)은 DNA의 원하는 부분을 증폭하는 기술로서 소량의 유전물질로부터 염기 순서가 같은 유전물질을 많은 양으로 증폭할 수 있다.- PCR는 3단계(DNA 변성, primer 결합, DNA 신장)로 진행된다.ⓐ DNA 변성- 섭씨 95도에서 열을 가해 2가닥의 DNA 염기 수소결합을 떨어뜨리는 과정이다.ⓑ primer 결합- 섭씨 55~65도에서 한 가닥의 DNA에 primer가 상보적 염기서열에 결합하는 과정이다.ⓒ DNA 신장- DNA 중합 효소를 이용하여 주형 DNA의 상보적 염기를 합성하여 두 가닥의 DNA로 신장하는 과정이다. 이후 앞의 과정을 반복하여 DNA를 증폭한다.◆ Materials : 실험 준비물- PCR 준비물 : PCR 큐브, 10 x buffer, Taq polymerase, dNTP mixture, Primer F, Primer R, 물(증류수), DNA(Bacillus, E.coli이며 배지 형태), 6μl 피펫, 200μl 피펫, 10μl 피펫 팁, 200μl 피펫 팁, 유전자 증폭기- 전기영동 준비물 : 전기영동기, 피펫, 팁, size marker, 6 x dye, PCR 결과물◆ Methods : 실험 과정- PCR 실험 과정① 준비된 두 PCR 큐브(큐브 A, 큐브 B)에 네임펜을 이용해서 각각 Bacillus와 E.coli의 라벨링을 했다.② 두 PCR 큐브와는 다른 PCR 큐브(큐브 C)에 투입될 물질에 대한 완충작용을 위한 10 x buffer 6μl를 투입했다.③ 큐브 C에 신장을 위한 dNTP 6μl, 적절 범위의 증폭을 위한 Primer F와 Primer R 각각 3μl를 투입했다.④ 큐브 C에 중합 과정을 위한 Taq polymerase 0.6μl를 투입했다.⑤ 큐브 C에 200μl 피펫으로 41.4μl의 물(증류수)을 투입했다.⑥ 큐브 C의 혼합물을 큐브 A와 큐브 B에 20μl씩 분배했다.⑦ 큐브 A와 큐브 B에 Bacillus와 E.coli를 각각 1 colony씩 피펫으로 투입했다.⑧ 유전자 증폭기에 큐브 A와 큐브 B를 넣었다.⑨ 초기 변성 시간은 확실한 변성을 위해 섭씨 95도에서 5분으로 설정한 뒤 이후 30초로 설정했다. 다음으로 섭씨 55도에서 30초, 섭씨 72도에서 2분으로 설정한 뒤, 이 과정을 30번 반복하도록 설정했다.⑩ 30회 반복 이후 DNA의 증폭률을 높이기 위해 섭씨 72도에서 5분 동안 추가로 처리할 수 있도록 설정한 뒤 보관 온도를 섭씨 12도로 설정했다.⑪ PCR 처리 동안 혼합물의 증발을 방지하기 위해 덮개 밑면 온도를 섭씨 105도로 설정했다.- 전기영동 실험 과정① 전기영동기에 전력을 공급하고 덮개를 열었다.② 전기영동기의 첫 번째 Agarose gel 레인에 전기영동 정상 작동 여부를 판단하기 위한 size marker를 3μl 투입했다.③ 6 x dye 1μl와 두 균주의 PCR 결과물 5μl를 각각 섞고 size marker 옆의 전기영동기 레인에 투입했다. dye는 UV를 사용한 관찰이 가능하게 한다.④ 전기영동기의 덮개를 닫고 100V에 25분 동안 처리를 했다.◆ Result : 실험 결과① PCR과 전기영동을 이용해서 미생물의 유전자를 증폭하고 미생물의 분류를 동정하는 과정에 대해 학습했다.② 제공된 16s rRNA sequence를 분석하기- 실험 후 별도로 제공된 서열을 가지고 어떤 미생물인지 동정했다.- 위의 서열을 분석하여 동정했다.- U.S. National Library of Medicine에서 제공하는 16S rRNA sequence 분석을 통해 동정하였다.- 분석 결과 Chryseobacterium 속의 yeoncheonense로 확인되었다. 프로그램을 사용하여 미생물을 동정하는 과정을 실습했다.◆ Discussion : 실험 후 고찰① PCR의 종류 조사ⓐ Conventional PCR(End-point PCR)- 일반적인 PCR이고, DNA의 증폭을 모두 마친 뒤 결과 확인이 가능하다.- PCR 후 UV 하에서 관찰하는 별도의 확인 과정이 필요하다.- 증폭된 산물의 크기를 측정할 수 있다(전기영동).- 증폭 시간이 길어 민감도가 떨어지고 비특이적 반응이 발생할 확률이 높다.ⓑ Real-time PCR- 정량 PCR이라고 불리고 DNA를 증폭하는 중 확인이 가능하다.- DNA probe 등이 F, R Primer 이외에 필요한데, 형광 값을 읽기 위함이다.- PCR 산물의 크기를 측정할 수 없다.- PCR 장비 이외의 분석 기기가 필요하지 않다.ⓒ RT-PCR- 역전사 중합 효소 연쇄 반응이라고 불린다.- 역전사 효소를 사용하여 역전사 반응을 시행하고, 합성된 DNA를 주형으로 PCR을 진행한다.- 형광물질을 같이 사용하여 DNA를 증폭시키면서 증폭 산물을 동시에 검출할 수도 있는데 이는 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응(real time RT-PCR)이라고 한다.ⓓ Digital PCR- 수 만개의 미세 방울(droplet)을 이용하여 DNA를 증폭하는 기술이다.- 미세 방울에 각각 한 copy의 주형 유전자와 Primer를 넣어 하나의 소자 형태로 PCR 증폭을 한다.- 반응이 완전히 완료된 후 증폭된 양을 검출한다.- 극소량의 시료로도 유전자 증폭 결과를 도출할 수 있다.

자연과학| 2022.01.09| 7페이지| 1,500원| 조회(493)

PCR, RNA, DNA, 전기영동, 염기서열, 중합효소연쇄반응, polymeras..

미리보기

닫기
미생물 관찰 및 염색(그람 염색 현미경 관찰)

◆ Date : 2021 / 05 / 04◆ Group : 연구조◆ Title : 미생물 관찰 및 염색◆ Introduction : 현미경과 총 균수 측정법, 그람 염색법① 현미경ⓐ 광학 현미경(light microscopy, optical microscopy)- 주변 환경과 세포의 대비 차이를 이용해 관찰하는 현미경이다.- 주로 세포를 염색하는 과정이 포함된다.- 광학 현미경의 한 종류인 명시야 현미경은 물체에 의한 가시광선의 흡수 차이를 이용하여 관찰하고 관찰하는 시료를 염색하고 고정하는 과정에서 세포가 죽게 된다.- 광학 현미경의 한 종류인 차등 간섭 위상차 현미경은 빛이 물체를 통과할 때 주변보다 속도가 느려지는 현상을 이용하여 관찰하고, 살아있는 세포를 관찰하는 것이 가능하다.ⓑ 전자 현미경(electron microscopy)- 가시광선이 아닌 전자를 이용하여 시료를 관찰하는 현미경이다.- 분해능이 매우 뛰어나고 1nm의 생물 시료까지 관찰할 수 있다.- 전자 현미경의 종류 중 하나인 투과 전자 현미경(transmission electron microscope, TEM)은 0.2nm의 분해능을 가지고 2차원 단면의 평면 관측을 할 수 있다. 관측 대상의 물질을 중금속으로 염색하는 양성 염색과 관측 대상의 주변을 중금속으로 염색하는 음성 염색 등을 동반하여 관찰한다.- 전자 현미경의 종류 중 하나인 주사 전자 현미경(scanning electron microscope, SEM)은 10nm의 분해능을 가지고 세포 전체의 3차원적 모습을 관찰할 수 있다.ⓒ 형광 현미경(fluorescence microscope)- 광원이 시료 내의 형광염색분자를 자극하여 방출하는 형광을 모아 상을 형성하는 현미경이다.- 동초점 현미경(confocal microscope)은 시료의 특정 초점 위치에서만 방출되는 형광만을 모아 상을 형성하고 살아있는 세포의 3차원적 이미지를 구현할 수 있다.- 다광자 현미경(multi-photon excitation microscope)은 두 광자가 동시에 형광 색소에 흡수되어 방출하는 형광에 의한 이미지를 형성하고 살아있는 세포의 3차원적 이미지를 형성할 수 있다.② 총 균수 측정법- Petroff-Hausser counting chamber를 이용하여 현미경 상에서 직접 세포를 세는 균수 측정법이다.- 작은 16개의 square로 이루어진 하나의 large square를 단위로 하여 그 영역 안에 존재하는 cell을 센다.- 다른 3~4개의 large square의 cell을 세고 평균을 계산한다.- 위의 평균값에 총 large square 수를 곱해준다(제곱 밀리미터 당 세포 수).- 위의 값에 coverslip과 slide 사이의 거리의 역수를 곱해준다(세제곱 밀리미터 당 세포 수).- 위의 값에 10의 세제곱을 곱해준다(밀리리터 당 세포 수).③ 그람 염색법(Gram-staining)- 세균을 염색하는 방법 중 하나로 세균의 Peptidoglycan 층을 염색하여 현미경으로 관찰하는 방법이다. 세균을 그람 음성균(Gram-negative)과 그람 양성균(Gram-positive) 두 그룹으로 구분할 수 있다.- Peptidoglycan은 N-acetylglucosamine과 N-acetylmuramic acid의 두 변형 포도당이 교대 결합한 형태에 펩타이드가 결합하여 생성된 구조물이다. Bacteria 세포벽의 주성분이고 그람 음성균과 그람 양성균에 각각 다른 비율로 함유되어 있다.- 그람 음성균은 염색 시 분홍색 빛을 띠고 그람 양성균은 염색 시 더 짙은 보라색 빛을 띤다.- 그람 염색은 열고정, 크리스털 바이올렛을 이용한 염색, 아이오딘을 이용한 표백, 사프라닌 과정을 거쳐 진행된다.◆ Materials : 미생물 관찰 및 염색(Gram staining) 준비물균주 : Bacillus 속 균, E.coli시약 : 크리스털 바이올렛, 아이오딘, 사프라닌기타 준비물 : 슬라이드 글라스, 커버 글라스, 피펫, 팁, 알코올램프, 점화기(라이터), 킴테크 휴지, 70% 에탄올, 물, 초시계◆ Methods : 실험 과정① 실험 균주인 Bacillus 속 균과 E.coli를 준비했다.② 두 균주를 각각 다른 슬라이드 글라스에 피펫과 팁을 이용하여 20μl씩 올리고 넓게 펴 주었다.③ 두 균주를 각각 점화된 알코올램프를 이용하여 열고정 해주었다. 액체 균주 상태의 미생물이 슬라이드 글라스 위에서 움직이지 않고 염색이 효과적으로 될 수 있도록 했다. 이때 너무 오랜 시간 가열하여 미생물이 손상되지 않도록 주의했다.④ 열고정이 끝난 뒤 크리스털 바이올렛 시약을 각 슬라이드 글라스 위에 떨어뜨린 뒤 30초간 대기했다. 휴대전화의 초시계로 시간을 측정했다.⑤ 이후 슬라이드 글라스를 뒤집어 뒷면에 물을 뿌려 크리스털 바이올렛 시약을 씻어낸다. 이때 고정된 미생물의 희석 및 손상을 막기 위해 슬라이드 글라스를 뒤집어 물을 뿌렸다.⑥ 킴테크(휴지)를 이용하여 조심스럽게 물기를 제거해주었다. 이때 고정된 미생물이 손상되지 않도록 주의했다.⑦ 각 슬라이드 글라스 위에 아이오딘 50μl를 떨어뜨리고 1분 30초간 대기했다. 아이오딘을 이용한 과정은 decolorize를 위한 것이었다.⑧ 이후 70% 에탄올을 슬라이드 글라스 뒷면으로 흘려주어 시약을 세척했다. 에탄올을 사용한 다음에는 물을 이용하여 한 번 더 씻어주고 휴지로 물기를 제거해주었다.⑨ 각 슬라이드 글라스에 사프라닌 한 방울을 떨어뜨린 후 30초간 대기했다. 효과적인 대조염색을 위한 과정이었다.⑩ 이후 슬라이드 글라스 뒷면으로 물을 흘려 세척한 뒤 물기를 닦아주었다.⑪ 커버 글라스를 고정된 미생물이 손상되지 않도록, 기포가 생기지 않도록 조심스럽게 덮었다.⑫ 두 프레파라트를 광학 현미경을 사용하여 관찰하였다. 이때 관찰은 저배율에서 고배율로, 조동 나사와 미동 나사를 적절히 사용하여 초점을 맞추어 실시했다.◆ Result : 실험 결과① 그람 염색 실험 결과 두 미생물이 성공적으로 염색되었고 현미경으로 명확히 관찰되었다. 관찰된 모습을 사진으로 찍어 기록하였다.Bacillus 속 균 E.coli 균- 실험 결과 Bacillus 속 균은 보라색으로 관찰되었다.- 실험 결과 E.coli는 분홍색으로 관찰되었다.② Peptidoglycan의 함량에 따라 달라지는 색에 의해 그람 양성균과 음성균 여부를 파악할 수 있다.- Bacillus 속 균은 보라색으로 관찰됨에 따라 그람 양성균으로 확인되었다.- E.coli는 분홍색으로 관찰됨에 따라 그람 음성균으로 확인되었다.◆ Discussion : 실험 후 고찰① 그람 양성균과 그람 음성균의 특징과 종류 조사ⓐ 그람 양성균- 색소나 약제에 대한 감수성이 높다.- 대사작용에는 아미노산과 비타민이 필요하다.- 일부는 균체외독소를 방출하고 이 독소의 작용은 균종에는 강력하나 가열하면 쉽게 파괴된다.- 포도상구균, 연쇄상구균, 디프테리아, 파상풍균, 탄저균 등이 있다.ⓑ 그람 음성균- 일반적으로 색소에 대한 저항력이 강하다.- 계면활성제 등에 내성이 강하다.- 생존에 필요한 영양적 요구가 간단하고 단순한 구성의 환경이나 배양액에서도 잘 자란다.

자연과학| 2022.01.08| 7페이지| 1,500원| 조회(624)

현미경, 그람염색, 대장균, 그람양성균, 미생물관찰, 그람음성균, 미생물염색, 대장균..

미리보기

닫기
판매자 표지

미생물 생장 실험(생장 측정, 생장 곡선, 세대 시간 계산)

◆ Date : 2021 / 05 / 04◆ Group : 연구조◆ Title : 미생물 생장 실험◆ Introduction : 미생물 생장 측정 방법, 미생물 생장 곡선, 세대 시간1. 미생물 생장 측정 방법A. 혼탁도 측정법① 세포 수의 증가에 비례하여 세포 양도 증가하므로 빛을 산란시키는 세포 현탁액의 혼탁도를 분광광도계로 측정해서 세포 양을 측정하는 방법② 세포의 농도가 높을수록 빛이 더 많이 산란되어 혼탁도가 증가B. 생균 수 측정법① 생균(viable cell)은 분열할 수 있는 세포이고, 생균 수 측정법에는 세포 염색법, 평판 계수법 존재② 세포 염색법은 ‘trypan blue’라는 죽은 세포에 특이적으로 염색이 되는 시약을 사용하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하여 생균 수를 측정하는 방법.③ 평판 계수법은 일정한 배수로 희석한 배양액을 배지에 접종하면 미생물이 증식하여 형성되는 집락(colony)의 수를 세는 방법2. 미생물 생장 곡선A. 유도기(lag phase)① 균을 새로운 배지에 접종하여 배양할 때 배지에 적응하는 시기② 세포가 새로운 환경에서 증식하는데 필요한 각종 효소단백질을 생합성하는 시기B. 대수기(exponential phase)① 세포가 대수적으로 증식하는 시기② 세대 시간, 세포의 크기가 일정한 시기C. 정지기(stationary phase)① 생균 수는 일정하게 유지되고 총 균 수는 최대가 되는 시기② 일부 세포가 사멸하고 다른 일부의 세포는 증식하여 사멸 수와 증식 수가 거의 같고 대사 생산물의 축적, 배지 pH의 변화, 산소 공급의 부족 등 부적당한 환경이 되어 생균 수가 증가하지 않는 시기D. 사멸기(death phase)① 생균 수가 감소하는 시기② 영양분 고갈과 미생물의 대사 노폐물로 인해 생육에 최고로 열악한 시기3. 세대 시간A. 세대 시간이란① 이분법으로 생장하는 단세포 생물에서 세대 시간은 군집에서 단세포 생물의 수가 두 배로 늘어나는데 걸리는 시간을 의미② doubling time이라고도 부름B. 세대 시간 계산d = 1회 분열에 걸리는 시간t = 분열하는데 측정하는 총 시간n = 분열 횟수a = 처음 세포 수b = 최종 세포 수◆ Materials : 분광광도계를 활용한 혼탁도 측정법 준비물실험 준비물 : E.coli 균주, 액체 배지, disposable cuvette PMMA, 200μl 피펫, 1mL 피펫, 피펫용 팁, safety cabinet, 분광광도계◆ Methods : 실험 과정① 오후 4시, 최초 E.coli 균주의 OD(optical density)를 측정하고 적당하게 희석한 후 섭씨 37도에 보관한다.② 오후 6시, 섭씨 37도에서 회전 운동을 하며 보관되던 0.1 OD로 희석된 E.coli 균주를 준비했다.③ safety cabinet에서 200μl 피펫, 1mL 피펫 그리고 피펫용 팁을 이용해 하나의 disposable cuvette PMMA에 100μl의 E.coli 희석 균주와 900μl의 액체 배지를 투입하여 희석을 진행했다.④ 또 다른 disposable cuvette PMMA에 1mL 피펫을 이용해 액체 배지 1mL를 투입하였다. 이는 정확한 OD 값 측정을 위한 대조군이다.⑤ 두 disposable cuvette PMMA를 분광광도계에 1번, 2번 자리에 넣은 후 분석을 했다. 이때 두 disposable cuvette PMMA를 넣고 분광광도계를 닫은 후‘zero’를 눌러 표시된 값을 초기화하고‘start’를 눌러 작동시키며 이후‘CE’버튼을 이용해 적절한 값을 찾아주었다.⑥ OD 값이 측정되면 해당 값에 10을 곱해 희석값 보정을 해주고 기록하였다.⑦ 실험에 사용한 두 disposable cuvette PMMA를 폐기하였다.⑧ 이후 8시, 10시, 12시에 2시간 간격으로 위 과정을 반복했다.◆ Result : 실험 결과① 각 시간대 OD 값6시 ? 0.24 8시 ? 1.3210시 ? 1.81 12시 ? 2.30② 데이터에 기반한 미생물 생장 곡선③ 생장 곡선 분석과 세대 시간 계산ⓐ 초기 측정된 E.coli 균주 2.5 OD를 25배 희석하여 0.1 OD의 E.coli 균주를 얻었다.ⓑ 4시 이후로 2시간 단위로 측정한 OD 값의 변화는 위 그래프와 같았다.ⓒ 실선으로 연결된 그래프 부분은 실험적으로 측정된 값을 의미하고, 점선으로 표시된 부분은 실험적으로 측정되지 않았으며 예측된 값이었다.ⓓ 4시부터 6시는 OD 값의 증가 폭을 보아 미생물이 배지 환경에 적응하는 Lag phase로 파악하였다.ⓔ 6시부터 8시의 증가 폭이 매우 가파르고 12시까지 조금씩 증가 폭이 감소하는 것으로 보아 해당 구간을 Exponential phase로 파악하였다.ⓕ 12시 이후의 실험데이터가 존재하지 않아 12시까지 기울기 변화를 통해 12시 이후 Stationary phase가 진행될 것으로 예상했으며 이후 Death phase가 진행될 것으로 예상했다.ⓖ E.coli의 OD 값이 제일 폭발적으로 증가한 6시부터 8시까지의 데이터를 기반으로 세대 시간을 계산하였다.120분/{3.3 x log(1.32/0.24)} = 약 49.12분E.coli의 세대 시간을 구성하는 세 단계는 복제, 분열, 휴식으로 나눌 수 있었다. 보통 복제와 분열을 20분이라는 시간 내에 이루어진다. 그러나 휴식기의 차이로 인해 실제 E.coli의 주기는 20분에서 1시간 사이로 계산되었다.◆ Discussion : 실험 후 고찰① 미생물 생장의 다른 측정 방법 조사ⓐ 건조중량을 이용한 세포 질량 측정- 미생물 집단이 생장함에 따라 세포의 수와 함께 총 세포 질량이 증가하는 원리를 이용한 측정법으로, 직접적인 방법으로는 건조중량을 측정한다.- 액체배지에서 자란 세균을 원심분리법으로 모아 세척하고 말린 후 질량을 측정한다. 그러나 이 과정은 시간이 많이 걸리고 정확하지 않다.ⓑ 막 여과지를 사용한 여과 측정- 세균을 걸러낼 수 있을 정도로 작은 구멍이 뚫린 특수한 막 여과지를 사용한 미생물 수 측정법이다.- 시료를 특수한 막 여과지로 걸러낸 뒤 여과지를 한천배지에 올려 세포가 서로 분리된 집락을 형성할 때까지 배양한 후 집락의 수를 측정한다.- 특정 미생물만을 선택해 계산할 수 있고 수질검사에 특히 유리한 방법이다.ⓒ 호흡률 측정- 미생물이 호흡에 사용하는 산소의 양을 측정하고 이를 해석하는 방법이다.- 미생물의 생장에 따른 호흡률의 증가를 곡선형 그래프로 표현하여 파악할 수 있다.- 산소가 미생물의 생장과 기질의 소모에 직접 관여한다는 점에서 미생물의 생장적 특성을 분석하는데 또한 알맞은 방법으로 알려졌다.② 미생물 생장에 영향을 미치는 환경 요인 조사ⓐ 온도- 미생물마다 생장에 최적화된 온도를 가지고 이 온도를 최적 온도라고 하며 이 온도에서 환경 온도가 멀어질수록 생장률이 감소한다.- 최적 생장 온도가 섭씨 10도에서 15도인 미생물을 저온성 미생물이라고 하며 냉장 조건에서 흔히 분리된다.- 최적 생장 온도가 섭씨 25도에서 40도인 미생물을 중온성 미생물이라고 하고 질병을 일으키는 대부분의 세균들이 이곳에 속한다.- 최적 생장 온도가 50도 이상인 미생물을 고온성 미생물이라고 하고 섭씨 90도 이상의 온도에서도 분리된 바 있다.ⓑ 산소- 산소의 유무는 특정 미생물이 살아갈 수 있는 환경인지, 그렇지 않은 환경인지 구분할 수 있는 중요한 척도가 될 수 있다.- 대사 과정에서 필요한 에너지를 생산하고 이를 위해 최종 전자수용체로서 산소를 이용하는 절대 호기성균이 있다.- 특정 효소의 부재로 산소에 노출되면 세포에 독성을 띠는 물질이 축적되는, 산소가 있으면 살 수 없는 절대 혐기성균이 있다.- 산소가 있으나 없으나 모두 생장할 수 있는 균으로 에너지를 생산하기 위해 최종 전자수용체로 산소 또는 다른 화합물을 사용하는 통성 혐기성균이 있다.ⓒ pH

자연과학| 2022.01.02| 7페이지| 1,500원| 조회(2,138)

분광광도계, 미생물학실험, 미생물생장, 미생물생장곡선, 미생물세대시간, 혼탁도측정

미리보기

닫기
판매자 표지

미생물 배양, 미생물 접종 및 순수 분리와 CFU 계산

◆ Date : 2021/03/30◆ Group : 연구조◆ Title : 미생물 배양 및 순수 분리◆ Introduction : 미생물 접종, 배양 방법과 콜로니 형성 단위1. 미생물 접종 방법A. 선상 도말법(Streaking)① 계대배양 : 배양된 미생물의 증식을 위해 새로운 배지로 옮겨 미생물의 대를 이어 배양하는 것이다.② 순수배양 : 목적으로 하는 한 종의 미생물만이 성장할 수 있도록 배양하는 것이다.③ 선상 도말 : 계대배양 및 순수배양 상태를 확인하기 위한 목적으로 이루어지며, 미생물 집락의 특성을 바탕으로 확인되기 때문에 각 집락은 단일 집락(single colony)으로 관찰되어야 한다. 루프를 사용하여 1차~4차 선상 도말이 이루어지며 각 선상 도말 간 미생물의 농도 희석이 이루어진다.B. 평판 도말법(Spreading)① 선상 도말과는 다르게 전체적으로 균주를 도말해주는 것이다.② 스프레더를 사용하여 이루어지며 피펫으로 균주 액을 배지에 분주한 이후 균주 액이 배지의 모든 면에 스며들 때까지 도말한다.2. 미생물 배양 방법A. 평판 배양법(plate culture)- 한천, 젤라틴 등의 교질상의 고형배지를 평판에 설치하는 배양이며 유리 접시 등에서 가장 일반적으로 사용한다. 조직배양, 화분배양 등에도 응용된다.B. 액체 배양법(Liquid culture)- 액체 배지를 사용하는 배양이다. 대량 배양에 적당하지만 오염이나 혼입의 위험이 크다. 액체 내 부유배양은 대량배양의 가장 일반적인 방법이다.C. 고체 배양법(Solid culture)- 고체 배양기 또는 단순 고체의 표면 또는 내부를 이용하여 균을 번식시키는 배양법이며, 일반적으로 호기적 배양법이다.3. 콜로니 형성 단위(Colony forming unit, CFU)- 콜로니 형성 단위는 눈에 보이는 세균의 숫자(콜로니)를 측정하는 것이다. 현미경으로 모든 세포의 수를 세는 것과는 달리, CFU를 측정하는 것은 직접 보이는 세포들을 측정하는 것이다. 즉, 배지에서 눈에 보이는 하나의 집락(colony)이 형성된 것을 기술하는 용어이다. 집락 형성 단위 하나를 1CFU로 표기한다.- CFU를 계산하는 방법은 아래와 같다.CFU/μl=[Number of colonies]/[Volume dispensed on plate(μl) x [Dilution factor]◆ Materials : 미생물 접종에 필요한 실험 도구A. 생물 : 대장균이 배양된 고체 배지, 1/10^6 만큼 희석된 대장균 액체 배지B. 접종 기구 : 루프, 스프레더, 파이펫, 팁, 고체 배지C. 기타 기구 : 에틸알코올, 라텍스 장갑, 유성펜◆ Methods : 실험 과정1. 선상 도말을 이용한 대장균 접종① 실험에 앞서 라텍스 장갑을 착용하고 에틸알코올을 이용해 멸균했다.② 미리 준비된 빈 고체 배지 바닥면에 접종할 미생물과 이름, 날짜를 기록했다.③ 대장균이 배양된 고체 배지에서 루프를 이용해 대장균을 채취했다.④ 채취한 대장균을 빈 고체 배지에 1차 접종했다. 이때 특정 접종 부위에 대장균이 몰리지 않도록 펴서 도말했다.⑤ 두 도말 부위가 겹치면 희석의 효과가 현저히 줄어들기 때문에 1차 도말 부위에서 루프를 이용해 대장균을 배지 위로 길게 끌어온 후 1차 도말 부위와 겹치지 않게 2차 도말을 했다.⑥ 2차 도말 부위에서 루프를 이용해 대장균을 배지 위로 길게 끌어온 후 1차 도말 부위와 겹치지 않게 3차 도말을 했다.⑦ 3차 도말 부위에서 루프를 이용해 대장균을 배지 위로 길게 끌어온 후 1차 도말 부위와 겹치지 않게 4차 도말을 했다. 4차 도말 시 1차 도말 부위와 접촉하지 않도록 주의했다.⑧ 배지의 뚜껑을 닫아 습기에 의한 손상을 방지하기 위해 뒤집어 보관했다.2. 평판 도말을 이용한 대장균 접종① 실험에 앞서 라텍스 장갑을 착용하고 에틸알코올을 이용해 멸균했다.② 배지 바닥면에 접종할 미생물과 액체 배지 희석도, 실험자 이름과 날짜를 기록했다.③ 파이펫의 추출 용량을 200μl로 조절한 후 끝부분에 팁을 끼웠다.④ 1/10^6 만큼 희석한 대장균 액체 배지 200μl를 추출했다.⑤ 빈 고체 배지에 액체 배지 200μl를 올렸다.⑥ 스프레더를 사용하여 고체 배지 위에 액체 배지를 넓게 펴주었다.⑦ 액체 배지가 흐르지 않을 정도로 펴주었다.⑧ 배지 뚜껑을 덮어 뒤집어 보관했다.◆ Results : 실험 결과1. 선상 도말을 이용한 대장균 접종 결과① 접종 결과 총 세 단계를 걸쳐 희석한 대장균이 배지에 나타났다.② 도말 부분이 서로 겹치지 않게 나타났다.고찰 : 배양된 대장균에서 1차 도말을 위해 채취할 때 양을 더 적게 해도 좋을 것이다.2-1. 평판 도말을 이용한 대장균 접종 결과① 접종 결과 colony가 정확하게 나타났다.② 배지 내부의 각각 다른 colony를 count 한다.고찰 : 도말 시 멸균을 확실히 해야 한다.2-2. CFU 계산 결과① 실험이 잘 실행된 위의 배지로 CFU를 계산한다.② 위 배지에는 총 35 colonies가 관찰되었다.③ 희석 배수는 10^-6에 해당하고 200μl의 액체 배지가 사용되었다.④ CFU/μl = 35 colonies / (200μl x 10^-6) = 1.75 x 10^5 colonies(cells)/μl◆ Discussion : 실험 후 고찰1. 대장균의 특징에 대한 조사A-1. 대장균이 합성할 수 있는 비타민은 제한된다.① 대장균이 합성할 수 있는 비타민은 비타민 K 비타민 B5, 바이오틴이다.② 위 비타민은 대장에서 생성되므로 섭취하지 않아도 결핍증이 생기지 않는다.고찰 : 인간은 비타민을 매개로 대장균과 공생하기도 한다. 대장균과 다른 비타민과의 관계는 무엇이 있을까.A-2. 그람음성균으로서 변성된 비타민 D에 의해 생장에 악영향을 받는다.① 변성된 비타민 D에 노출된 대장균은 정상적인 분열 과정을 통한 증식이 진행되지 않는다.② 변성된 비타민 D는 대장균의 genomic DNA 및 plasmid DNA에 영향을 준다.고찰 : 대장균을 변성 비타민 D에 노출 시켜 토양에 투여 후 식물을 생장시키면 토양 미생물 구성에 문제가 발생한다.B. 병원성 대장균은 시가독소를 생성하고 식중독을 유발한다.① 병원성 대장균인 시가독소 생성 대장균은 설사증, 출혈성 대장염 등을 유발한다.② 시가독소 생성 대장균에 의한 세포독소는 신장의 베로세포에 독성을 나타낸다.고찰 : 시가독소 생성 대장균에 대한 제어를 위해 다양한 물리적 방법, 화학적 방법이 연구되어야 한다.C. 대장균의 mRNA 번역 속도는 상당하다.① 대장균 리보솜의 mRNA 번역 속도는 인간의 번역 속도보다 10배 빠르다.고찰 : 대장균이 다른 생명체의 유전자를 번역할 때 단백질의 합성 속도와 동력 차이로 인한 문제가 발생할 수도 있다.D. 대장균은 운동성을 가지고 있다.① 대장균은 편모를 가지고 있고 편모는 clockwise tumbling과 counterclockwise running으로 회전할 수 있다.② 대장균은 주화성(외부의 화학 물질 농도를 자극으로 하여 농도의 증가 혹은 감소 방향으로 세균의 전체 이동 방향을 결정하는 성질)에 의한 운동성을 가진다.고찰 : 대장균은 생체 내부 요인이 아닌 외부의 요인으로 인한 움직임을 가진다.2. 미생물 보존법의 종류에 대한 조사A. 계대배양① 일정 기간에 한 번씩 적정 배지에 옮겨 배양하는 방법B. 건조(Drying)① 주로 곰팡이류의 보존에 널리 적용됨

공학/기술| 2022.01.01| 7페이지| 1,500원| 조회(1,613)

대장균, 순수분리, 미생물배양, 콜로니, 미생물접종, CFU

미리보기

닫기