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코페르니쿠스 혁명 서평

코페르니쿠스 혁명은 과연 전형적인가?토머스 쿤의 저작 "코페르니쿠스 혁명"은 16세기 코페르니쿠스의 책 한권 "천구의 회전에 관하여"부터 시작된 과학 분야에서의 혁명에 대해서 다룬다.기존 체계였던 2구체 우주와 주전원-주원 기법은 경제적이고 생산적이었다. 이 우주론은 아리스토텔레스 사상, 신의 권능과 굉장히 단단하게 결부되어 기각하기 매우 까다로운 관념이 되어 사람들의 머릿속에 박혔다. 그렇기에 고대 체계가 세워진 이후로 천년이 넘는 시간동안 천문학 분야에서는 거의 아무 일도 일어나지 못했다. 그렇다고 혁명이 갑작스럽게 나타난 것은 아닌데 저자는 그 혁명이 왜 16세기 시대에 일어날 수 있었는지에 대한 시기적인 원인에 대해서 설명해준다. 아리스토텔레스주의에 대한 스콜라적 비판들, 달력 개혁 요구나 고전기법에 대한 의구심과 같은 시기적 상황, 인문주의로부터 파생된 신플라톤주의 등을 얘기하면서 이러한 요인들이 새로운 체계가 준비되기 위해 필요했던 기반이었다고 말한다. 이러한 배경 속에서 코페르니쿠스는 고전체계의 산만함, 지속적인 부정확성, 불균일성을 바탕으로 고전체계를 괴물로 바라보게 되었고 그 혁명적인 저작을 발표하게 된다.그의 저작이 발표된 직후 바로 혁명적이었던 것은 아니다. 하지만 그의 체계는 우주의 운동을 미적으로 질서정연하게, 코페르니쿠스의 서문에서의 표현을 빌리자면 수학적으로 정돈된 형태로 보여준 최초의 사례였다. 지구의 운동을 가정한다면 모든 행성들과 천구들, 그 순서와 크기가 서로 밀접하게 묶여 전체를 교란시키지 않고는 어떤 부분도 변경할 수 없었다. 이 신플라톤주의의 영향을 듬뿍 받은 그의 체계는 혁명의 시작을 알렸다. 비록 그의 저작 속에서는 이 미적인 조화, 대칭성, 결합성이 가려져 있었지만 그 미적 감각에 대한 통일된 사고체계 안에 동화시킬 새로운 물리학과 우주론이 필요했다. 중심이 없는 무한한 우주 개념, 물리학에서의 입자론적, 기계론적 설명이 그것이다. 이렇게 뉴턴의 입자론적 세계-기계가 건설되면서 코페르니쿠스의 개념적 설명은 완성된다. 이 뉴턴의 우주는 천문학을 위한 것만이 아니었으며 과학 전반의 분야를 더 풍요롭게 하고 종교 철학과 정치를 모두 탈바꿈시켰다.토머스 쿤은 코페르니쿠스의 혁명은 과학적 지식이 성장하는 순환과정의 전형을 보여준다고 말한다. 그의 말에 따르면 혁명을 통해 나온 체계는 기존의 체계에서는 상상도 할 수 없는 많은 것들을 정확하게 설명했으며 기존의 개념들을 포괄적으로 질서있게 설명한다. 과학의 진보는 현재의 개념들을 더 포괄적으로 질서있는 개념으로 설명할 수 있는 대안 체계로 이뤄진다. 즉, 뉴턴주의 우주는 최종적인 것이 아니며 과학혁명이 반복되는 과학사적 흐름 중 하나라고 얘기하며 책을 마친다.토머스 쿤의 다른 저작인 "과학혁명의 구조"에서는 과학혁명이 가지는 중요한 역할에 대해 강조한다. 그에 따르면 과학혁명은 과학사 전반에 걸쳐 자주 발생하는 일은 아니다. 대부분의 기간에서 과학자들은 과학 공동체 내에서 과학적 사고를 지배하는 공유된 기본 이론, 개념, 방법론인 "패러다임"을 따라서 과학 활동을 하게 되며 이러한 활동이 지속되는 기간을 "정상 과학"이라고 부른다. 하지만 이 패러다임에 대한 모순이 누적되어 다른 변칙을 설명할 수 없게 될 때, 이에 대처하는 새로운 접근 방식과 이론이 탄생할 수 있고 이 대안이 지지를 얻으면 "과학혁명"이 일어나게 된다. 토머스 쿤은 이런 식으로 과학의 진보를 정상과학기간과 과학혁명기간으로 나누어서 설명한다. 프톨레마이오스 체계가 정설로 받아들여졌던 시기와 코페르니쿠스 혁명 또한 과학혁명의 구조를 잘 따르고 패러다임 전환의 대표적인 사건이라 생각한다.동시에 쿤은 이 코페르니쿠스 혁명이 과학혁명의 전형적인 면을 많이 포함하고 있다고 주장했다. 앞서 말했듯 나는 코페르니쿠스 혁명이 과학혁명의 구조를 따르고 재의 어떤 이론보다 고전 체계를 기각시키기 어려운 이론으로 만들었다. 먼저 종교적 측면의 경우 혁명이 진행되는 과정 전반에 혁명의 완수를 방해하고 늦추는 가장 가시적인 원인이었다. 혁명 이후에도 종교의 개입은 이어졌지만 그 영향력은 점점 약해졌으며 현대 과학에서 종교를 진지하게 과학과 결부시키는 일은 찾아볼 수 없게 변하였다.더 중요한 특징은 고전 체계와 단단하게 결부되어있던 아리스토텔레스 체계가 가지고 있던 특징이다. 고전 체계를 떠받들고 있던 아리스토텔레스 사상은 그 자체로 고도의 체계성과 통일성을 가지고 있었다. 아리스토텔레스의 우주론, 물질론, 운동론은 서로 긴밀하게 결부된 하나의 통일 체계였고 많은 도구주의적 천문학에 탄탄한 기반이 되어주었다. 이 점이 고전 체계를 긴 시간 동안 기각의 대상조차 되지 못하게 만들어준 두 번째 주요한 원인이었다.하지만 과학혁명 기간에 시험대에 오르는 모든 기존 체계는 마찬가지로 여러 관념과 주변 학문과의 통일성을 바탕으로 격렬하게 저항한다. 뉴턴으로부터 시작된 고전역학 또한 우주론, 입자론, 기계론적 사고 등 많은 사상, 이론들과 견고하게 결합이 되어있었고 강하게 저항했다. 그럼에도 새로운 체계와 관측들이 모이며 새로운 양자역학은 빠르게 도입되었는데 고전역학의 한계인지부터 양자역학의 도입 기간을 본다면 그 기간은 코페르니쿠스 혁명과 비교도 할 수 없을 만큼 빠른 것을 확인할 수 있다.이러한 차이의 가장 큰 원인은 혁명 이전 기반이었던 아리스토텔레스 사상이 갖고 있던 특징에서 찾아볼 수 있다. 이를 확인하기 위해서는 아리스토텔레스 사상을 기각할 수 있게 된 배경에 대해서 분석할 필요가 있다. 과학자가 미지에 대상에 대한 여러 가지 체계 중 하나를 믿을 때는 경험적 적합성만을 따지지는 않는 것은 확실한 것 같다. 그렇다면 기존의 알려진 관찰목록을 만족시키는 여러 이론들이 있을 때 과학자는 어떤 이론을 선택하게 되는가? 다양한 요소가 관여하겠지만 그중에서 그 체계가 미적으로 조화로운지의 여부가 굉장히 큰 영향을 미친다고 생각념은 신플라톤주의로부터 이어져서 갈릴레오에 의해 현실화된 자연의 수학적 기술의 가능성에 대한 믿음이다. 고대의 자연철학은 수학은 그냥 기하학적 도구에 불과했으며 정성적인 면을 다룰 수 없기에 본질에 다가갈 수는 없다고 믿어졌다. 수학은 사물의 겉보기 속성인 양적 측면만 묘사할 수 있을 뿐 본질적인 속성을 다루기엔 부적합하기 때문에 현상을 표현하기 위한 도구 그 이상 그 이하도 아니라는 관념은 여러 가지 행성체계를 물리적 실재로 진지하게 받아들여지지 않도록 했다.반면에 신플라톤주의자들은 자연에서 산술 기하적 규칙성을 발견할 수 있으며 수학이라는 방법을 통해서 실재를 기술할 수 있다고 믿었고 이것이 자연을 참되게 기술하는 방법이라고 믿었다. 수학적으로 통일된 기술을 통해 현상들을 포괄해서 설명하고 이것이 가진 미학적 의미를 발견하고 추구하는 과정, 이것은 혁명의 시작점인 코페르니쿠스의 저작에서도 발견된다. 열렬한 코페르니쿠스주의자였던 케플러는 이 수학적 조화를 매우 중요시하고 기하학적 조화에 목숨을 걸었으며 그가 주장하기를 세상은 관찰과 잘 어울리는 가장 단순한 방식으로 작동해야한다고 생각했다. 그 규칙성을 찾는다는 과학자의 사명을 다하여 3가지 법칙들을 발견했을 때 케플러가 얼마가 기뻐했을지 상상조차 가지 않는다. 이후 이러한 자연의 운동을 수학적으로 나타내려는 시도는 갈릴레오를 통해서 이루어진다.태양중심체계의 기반을 마련해줄, 아리스토텔레스 사상을 대체하고자 하는 노력이 이루어진다. 그 방법은 바로 이전에는 도구에 불과했다고 믿어졌던 수학을 통해서 이루어지게 된다. 갈릴레오는 운동의 개념 자체를 재정의하고 수학적으로 운동을 기술해 냈으며 그 이후 뉴턴은 운동의 제 3법칙을 이끌어내며 행성의 운동과 지상의 운동을 통합하면서 새로운 역학체계를 만들어 낸다.이러한 단순하면서 직관적이고 조화로운 수학적 기술은 혁명 과정과 결과를 통해 생긴 새로운 미적 기준이었다. 인간의 이성의 믿음의 끝판왕인 수학은 혁명을 통해 그 유용성과 중요성이 입증되었고 이후 과학 활동에 핵심 때까지 라그랑주 역학, 헤밀토니안 역학, 통계 역학, 전자기학 등 자연을 수학적으로 표현하려는 셀 수 없이 많은 세부 분야들이 과학혁명을 통해서 탄생했다.물론 혁명의 완수 과정에 이런 사상만이 작용한 것은 아니다. 뉴턴 체계는 무한한 우주, 입자론적 사상과 기계론적 철학의 도움으로 체계의 완결성을 보장받았으며 그 지위를 달성했다. 하지만 코페르니쿠스 혁명 이후 도입되었던 다른 사상 및 관념들과 비교해본다면 수학적 기술에 대한 맹목적 추구가 그 생존성이 얼마나 뛰어난지 알 수 있게 된다. 하지만 이러한 관념은 과학이 진보되면서 모두 기각되었다. 우주는 팽창하고(언제까진지는 몰라도), 빛 뿐만 아니라 물질도 입자-파동 이중성을 나타내며, 모든 입자의 위치와 운동량을 안다고 미래를 예측할 수 있지 않다. 이러한 일련의 진보 과정에서도 깨지지 않는 단 하나의 사상은 자연을 수학적으로 조화롭게 기술해야 한다는 생각이다. 지금도 과학자들은 수학적 방법으로 세상을 기술하기 위해 수많은 실험을 하고 수식을 풀어내며 노력한다. 그만큼 과학의 핵심이 되는 미적 기준이 코페르니쿠스 혁명을 통해서 설립된 것이라고 볼 수 있다. 양자역학의 기본인 슈뢰딩거의 파동방정식은 고전역학의 헤밀토니안 역학의 수학 체계를 사용한 것을 보면 수학적 기술에 대한 과학자의 믿음이 얼마나 대단한지 알 수 있다.그 미적 기준에 대한 정립은 이후 과학의 방향을 정해준다. 그 결과 물리학 뿐만 아니라 화학, 생물학 분야에서도 현상에 대한 수학적 기술을 찾아볼 수 있다. 다양한 방향으로 영향을 주었지만 가장 대표적으로 최종이론의 개발이 있다. 이런 수학적 기술에 대한 추구는 결국 최종이론에 대한 추구로 이루어지게 되어있다. 기존의 이론을 대체하여 이미 알려진 관측 뿐 아니라 새로운 현상을 예측할 수 있는 더 조화로운 수학적 기술이 계속 이어진다면 최종적으로는 모든 것을 아우르는 하나의 수식을 밝혀낼 수 있을 것이라 생각이 든다. 이러한 이론이 수학적 수식이 실재하는지는 모르겠지만 이를 밝혀내는 것을 목표로 다.

독후감/창작| 2023.06.15| 5페이지| 2,500원| 조회(177)

과학혁명, 서평, 과학철학, 코페르니쿠스

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[유전학 레포트] 유전자 복구 NHEJ와 HDR

NHEJ와 HDRAbstractBefore we take a closer look at the operational method of today’s topic NHEJ&HDR, I strongly insisted that we have to know why the DNA repair system is essential for human. When the damage caused by the endogenous and environmental factors accumulated genes strongly related to cancer such as proto-oncogenes or tumor-suppressor gene can be damaged, which means that chance of the cancer increases. So the repair system under DNA damage system exists, which contains various operational mechanisms such as MMR, BER, and also NHEJ and HDR which are today’s topic of the paper. When Double strand breaks occurs, there are two DNA repair systems processed; Non-homologous end joining(NHEJ) and Homology directed repair(HDR). HDR pathway occurs when DNA template present. NHEJ occurs without DNA template, however error rate becomes high than HDR pathway and mutation may occur. These DNA double strand repair mechanism can be applied in many bio-technology. NHEJ and HDR can be used in 을 넘어서게 되면 세포는 수선을 하는 것이라 아니라 세포사멸(apoptosis)을 유도하게 된다. DNA 복구 시스템에는 여러가지가 존재하는데 5개 정도의 주요 DNA 복구들 하에 우리의 주제인 NHEJ와 HDR이 속해 있다. 이 둘에 관해서는 뒤에서 자세하게 다룰 것이기 때문에 나머지 3가지에 대해서 언급하고자 한다. BER (Base Excision Repair), NER (Nucleotide Excision Repair), MMR (Mismatch Repair)이 바로 그것인데, BER은 산화나 탈아미노화 또는 알킬화로 인한 DNA 손상을 교정한다. 그러한 변화는 DNA의 나선 구조에는 거의 변형을 일으키지 않는데, BER이란 DNA glycosylase에 의해서 손상된 염기를 인식하고 이를 제거하는 것으로 시작되어 추가적으로 다른 여러 단백질들을 활용하여 작은 염기성 오류를 교정하는 것이다. 다음으로 NER은 게놈에서 매우 광범위한 손상 부위들을 제거할 수 있는 것으로 알려져 있는데, XPC 단백질 복합체는 DNA 손상 부위를 인식하는 것을 통해서 복구반응을 시작하고 그 중에서도 파괴된 염기쌍의 검출에 특히 의존한다. 주요하게도 NER은 특히나 자외선이나 여러 화학물질에 의한 환경 돌연변이에 의해서 발생하는 다양한 DNA 변형(손상)을 제거할 수 있다. 마지막으로 MMR은 특이적으로 주로 DNA의 복제에서 발생하고는 하는 염기 간의 불일치 혹은 삽입이나 누락 오류에 관여한다. 진핵생물과 원핵생물의 MMR에는 차이가 있지만 수많은 논쟁 끝에 MMR의 기본이 되는 MSH 단백질이 불일치를 먼저 인식하고 인접한 DNA를 따라서 가수분해 없이 확산되는 여러 개의 매우 안정적인 ATP-bound sliding clamps를 이용해서 시작하는 것으로 밝혀졌다.이러한 여러 DNA 수선 기작에 추가적으로 NHEJ와 HDR이 있다. 이들에 대해서는 이어지는 파트에서 보다 자세하게 알아보자.2. 방법적 접근2.1 NHEJ와 HDR의 차이점이렇게 생성된 DSB는 NHEJ ends를 가공하고, DNA를 복구한다. 먼저 DNA ends를 가공할 때는 5’ end의 nucleotide를 제거하여 3’ overhang을 형성한다, 이때 NHEJ에 비해서 가공하는 nucleotide의 양이 많은데, 수백 개의 nucleotide를 제거한다. 그리고 3’ overhang은 DNA template와 상호작용하여 D loop(displacement loop)를 형성하고, 복구 과정을 진행한다. HDR 과정은 가공 후 복구 과정이 어떻게 일어나느냐에 따라 크게 3가지로 분류할 수 있다.먼저 DSBR은 classical double-strand break repair의 약자로 일반적으로 일어나는 HDR pathway를 지칭한다. D loop가 형성되면 복구하고자 하는 DNA 가닥과 DNA template의 상호적인 가닥이 서로 결합한다. 이때 두 가닥 모두에서 DNA synthesis가 일어난다. DNA 가닥들이 복구된 후, D loop가 풀릴 때 DNA template 가닥과의 교차점이 절단된다. 그리고 절단된 DNA 가닥들이 어떻게 다시 결합하느냐에 따라 crossover가 일어날 수도 있다.SSDA는 synthesis-dependent strand-annealing의 약자로, D loop가 형성되고 한 가닥의 DNA에서만 DNA synthesis가 일어나는 경우를 지칭한다. 이때는 교차점이 절단되지 않고 D loop가 풀리며, 합성된 DNA를 바탕으로 나머지 한 가닥의 DNA의 복구도 진행된다. 이 경우에는 crossover가 일어나지 않는다.마지막으로 BIR은 break-induced repair의 약자로, DSB가 생성될 때 한 쪽 DNA 가닥들이 소실된 경우에 일어나는 DNA repair system이다. 이 경우에는 일단 3’ overhang이 DNA template와 D loop를 형성하여 DNA를 합성하고 D loop가 풀어진다. 그리고 합성된 DNA 가닥을 바탕으로 나머지 가닥의 합성이 일어난다. 여기까지의 과정은 SSDA와방법을 통해서는 vector가 세포에 삽입되었는지의 여부는 확인할 수 있지만 정말 원하는 부위에 삽입되었는지의 여부는 확인할 수 없다. 그렇기 때문에 두 번째 유전자를 추가적으로 이용하는데 그것은 thymidine kinase 유전자이다. 이 유전자는 vector 상에서 region of homology보다 바깥쪽에 위치하는데 만약 재조합이 제대로 일어나 유전자 안에 thymidine kinase가 없다면 thymidine kinase는 합성되지 않는다. 이후, 세포에게 gancyclovir라는 물질을 투여하는데 이 물질은 thymidine kinase에 의한 phosphorylation을 통해 세포를 사멸시키는 특성이 있다. 즉 제대로 된 위치에 유전자가 삽입된 세포는 thymidine kinase가 합성되지 않아 생존하지만 다른 위치에 삽입되어 thymidine kinase가 합성되는 세포들은 gancyclovir에 의해 사멸되는 negative selection 방법을 이용해 제대로 재조합된 세포를 얻어낸다.이렇게 만들어진 vector를 배아줄기세포에 주입시킨 다음 제대로 주입된 세포를 배반포에 주입한다. 이후 이 세포로부터 유래된 개체는 특정 gene이 knock out 혹은 knock in 되어 그에 따른 다른 표현형을 나타내게 된다.3.2 CRISPR-Cas9또한 유전자 편집기술에서도 DSB repair system이 사용된다. 현재 가장 잘 알려져있고 가장 널리 사용되는 CRISPR-Cas9 system에서도 마찬가지로 사용된다. CRISPR-Cas9 system은 3세대 유전자 편집 기술로서 현재 존재하는 genome editing technology 중 가장 정교하고 간편하고 효과적이기 때문에 다양한 목적을 가지고 사용된다. 이 기술은 각종 동물이나 식물의 형질 개량, 그리고 질병 치료 등 여러 연구 분야에서 사용되고 있으며 이 기술은 PCR에 맞먹는 현재 생명공학에서의 핵심적인 기술이라고 할 수 있다.CRISPR-Cas9은 원생생물에서 발견되e of depurination of native deoxyribonucleic acid. Biochemistry. 11(19):3610-3618.Rye PT, Delaney JC, Netirojjanakul C, Sun DX, Liu JZ, Essigmann JM. Mismatch repair proteins collaborate with methyltransferases in the repair of O(6)-methylguanine. DNA Repair (Amst). 2008 Feb 1;7(2):170-6..Hsu GW, Ober M, Carell T, Beese LS. Error-prone replication of oxidatively damaged DNA by a high-fidelity DNA polymerase. Nature. 2004 Sep 9;431(7005):217-21, 2004 Aug 22.Maynard S, Schurman SH, Harboe C, de Souza-Pinto NC, Bohr VA. Base excision repair of oxidative DNA damage and association with cancer and aging. Carcinogenesis. 2009 Jan;30Friedberg,2006; Lindahl, 1993; Sander et al.,2005: Sears and Turchi, 2012: Mouret et al., 2006.Chatterjee N, Walker GC. Mechanisms of DNA damage, repair, and mutagenesis. Environ Mol Mutagen. 2017 Jun;58(5):235-263. 2017 May 9.Friedberg,2006; Lindahl, 1993; Sander et al.,2005: Sears and Turchi, 2012: Mouret et al., 2006.Miriam C. Poirier, Ainsley Weston, in Hyperl5

자연과학| 2023.03.14| 13페이지| 1,500원| 조회(290)

유전공학, 생명공학, 유전학, 유전자, DNA repair, 유전자복구

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[통계학개론] 인과관계의 오류

인과관계 오류현대 과학 기술 문명의 발전과 암암은 세포가 사멸 주기를 무시하고 비정상적으로 증식을 시작하여 인체의 기능을 망가뜨리는 병이다. 이 병은 과거부터 꾸준히 인간을 괴롭혀 왔지만 현대사회로 들어오면서 더욱더 많은 인간들을 죽게 만들고 있다. 불과 50년 전까지만 해도 암으로 죽는 사람이 이렇게 많지는 않았고 독감, 결핵, 심장병 또는 뇌혈관 질환 등이 더 주요한 인류 사망 원인이었다. 하지만 대다수의 질병들은 과학기술이 발전하고 사회적 인프라가 갖추어진 이후에 정복되었고 최소한 완치는 아니더라도 환자가 죽지않게 만들 수 있게 되었다. 하지만 암의 경우는 그렇지 못하다. 현재 대한민국 국민의 사망 원인 1위를 10년 넘게 지키고 있으며 많은 사람에게서 발병하고 있으며 그 중 예후가 좋지 않아 사망에 이르는 경우도 아직 매우 많다.이런 상황에서 우리는 과학의 발전이 진행되는 것 때문에 암의 발병률이 높아지는 것은 아닌가 하는 인과관계를 마주하게 된다. 즉, 인간은 과거와 다르게 어떠한 이유 때문에 암에 더 잘 걸리게 되었으며 그 중심에는 과학기술에 발전이 있다는 것이다. 좀 더 구체적으로 인과관계를 특정해보자면 과학기술에 발전에 따라 인간은 본인들이 위험하다는 것을 인지하지 못하는 여러 발암물질에 노출될 기회가 많아지고 이 때문에 암 발병률이 증가한다 라는 식의 주장을 할 수 있을 것이다.하지만 이는 어느 정도 영향은 있을 수도 있지만은 절대로 주요한 인과관계가 될 수 없다. 암이라는 질병은 정상적인 세포 분열과정에서 돌연변이가 생기면 자연스럽게 생성될 수 있는 것이기에 사실 과거부터 쭉 존재하던 질환이었다. 또한, 노화가 암의 가장 큰 원인으로 꼽히는데 나이가 많아질수록 세포 분열과정에서의 오류가 빈번해지게 되고 이를 제거하는 면역체계도 약해지기 때문에 나이가 들수록 암에 걸릴 확률이 증가하게 된다. 과거에는 과학기술이 부족해 감염성 질병이나 사고, 혹은 전쟁 등 다른 요인으로 인간들이 많이 죽었기 때문에 암이라는 원인이 부각되지 않은 것이다. 현재 과학기술의 발달에 따라 감염성 질병으로는 사람이 쉽게 죽지 않게 되고 다른 요인들도 과학 기술과 사회적 기반 발달에 따라 주요 사망 원인이 되지 않고 있다. 즉, 암의 경우는 다른 사망 요인이 약해지며 인간이 더 오래 살게 됨으로서 떠오르는 사망원인인 것일 뿐이지 과학기술의 발전이 암 발병률을 높였다는 인과관계는 어불성설임을 알 수 있다.

자연과학| 2023.03.14| 1페이지| 1,000원| 조회(248)

과학기술, 통계학, 오류, 암, 인과관계, 상관관계

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[유전공학] CRISPR/Cas9 system과 관련논문 분석

CRISPR/Cas9 SystemSummarize the process for CRISPR/Cas9 constructionCRISPR/Cas9 System은 현재 가장 많이 사용되고 있는 3세대 Genome Editing 기술이다. 먼저, CRISPR란 박테리아에서 발견되는 짧은 회문서열을 뜻하는데 이는 박테리아가 박테리오파지에 대해 가지고 있는 adaptive immunity에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이 회문서열 사이에는 spacer라는 부위가 있는데 이 부위는 박테리아 고유의 DNA가 아니고 이전에 박테리아 내부에 침입한 경험이 있는 파지의 서열 일부를 이곳에 저장해 둔 것을 의미한다. 이를 통해 박테리아는 파지에 대한 memory를 갖게 된다. 이 부위가 전사되어 pre-crRNA가 생성되고나면 tracrRNA라는 다른 RNA fragment도 전사되어 pre-crRNA에 존재하는 회문서열에 상보적으로 결합하게 된다. 이 RNA 조합을 guide RNA라고 부른다. 이후 다른 핵심적인 단백질인 Cas9이 추가로 결합하는데 이 단백질은 DNA의 특정서열을 인식하고 이중가닥을 절단하는 효소이다. 이렇게 guide RNA와 Cas9가 붙어서 effector complex를 만들어내고 이 구조물은 guide RNA가 가지고 있는 파지의 DNA 서열을 상보적으로 인식하면 Cas9이 절단하는 형식을 갖추게 된다.그리고 인간은 이 시스템을 이용해 유전자를 편집하는 기술을 응용해낸다. 먼저 guide RNA를 RNA의 조합이 아닌 그냥 하나로 통합하여 합성한다. Guide RNA는 절단할 부위에 해당하는 염기서열을 포함하고 있는 부분인데 이 부분을 연구자의 입맛대로 변경해준다면 우리는 CRISPR/Cas9 System를 이용해서 생명체의 유전체 중 원하는 부위를 절단할 수 있을 것이다. 이러한 염기서열 제작은 지금의 분자생물학적 기술로 쉽게 가능하다.이렇게 원하는 부위를 절단했다면 우리가 원하는 서열을 삽입도 할 수 있게 된다. 진핵생물은 DNA가 손상되면 DNA를 복구하는 시스템을 갖추고 있다. Cas9에 의해 이중가닥이 절단되게 되면 주변에 존재하는 DNA template로 대체하는 시스템인 HDR(Homology Directed Repair)이라는 과정을 통해 DNA가 복구된다. 즉 우리는 생물의 유전체의 원하는 부위에 특정 염기서열을 삽입하고 싶다면 CRISPR 혼합체와 함께 HDR을 유도할 수 있는 DNA 서열을 주입해 주면 된다.Search for one article that describes novel CRISPR/Cas technology and summarize the paperPaper : Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA기존의 3세대 CRISPR/Cas technology는 필수적으로 double-strand DNA breaks(DSB)가 수반되었고 이는 의도치 않은 complex mixtures, translocation등의 부작용으로 이어졌다. 그렇기에 연구자들은 double-strand breaks를 일으키지 않는 다른 대안 유전자 편집기술을 개발하는데 노력하게 된다.논문을 쓴 연구자들이 찾아낸 방법은 prime editing을 발전시킨 search-and-replace genome editing이라는 technology이며 이를 통해서 targeted insertions, deletions, base to base conversion을 DSB없이, 게다가 추가적인 donor DNA templates의 주입 없이 해낼 수 있다.전략을 다음과 같다. 기존 시스템에서 Cas9 단백질은 spacer sequence를 갖고있는 guide RNA를 이용해 target DNA site에 결합하고 이를 절단한다. 이와 다르게 연구자들은 target DNA에 결합할 수 있는 특정한 서열과 더불어 기존 DNA 서열을 대체할 새로운 유전정보 서열을 guide RNA에 모두 포함시키는데 이를 pegRNA라고 부른다. 그리고 유전자 편집의 작동단위인 prime editing complex는 Cas9 nickase와 같이 RNA-guided DNA-nicking domain을 포함하고 있는 PE protein이 reverse transcriptase(RT), pegRNA와 결합된 형태를 하고 있다.우선 PE-pegRNA complex가 target DNA에 붙고 PAM-containing single strand를 자른다. 이후 3’ end를 포함하고 있는 부위가 Primer-binding site에 붙게되고 이후 RT에 의해 상보적인 DNA 서열을 생성하게 된다. RT에 의해서 상보적으로 elongation되는 pegRNA의 RNA 서열부위는 연구자가 원하는 염기서열로 의도하도록 하는데 이를 통해 삽입하고자 하는 서열을 만들어낼 수 있다. 이후 edited된 3’ Flap과 기존의 서열인 5’ Flap가 equilibration을 유지하게 되는데 이후 5’ exonuclease로 5’ Flap cleavage를 유도하면 edited된 3’ Flap부분만 존재하게 된다. 이후, ligation시키고 DNA repair을 시키면 Edited DNA가 만들어진다.연구자의 논문에 따르면 여러가지 cell lines로부터 테스트 해본 결과, 이 prime editing 방법은 HDR, DSB와 DNA templates을 사용하는 방법보다 btproducts가 생기는 비율이 더 낮았다는 것을 확인했다.또한, 단점으로는 큰 genetic alteration을 일으키기 어렵다는 것이 있다. 이를위해서는 긴 RT template이 필요한데 이는 pegRNA의 활성을 떨어뜨린다는 단점이 있다. 이 한계점을 보완한다면 더 좋은 기술로 발전할 수 있을 것이다.Summarize the principle of PCRPCR이라는 기술은 실험자가 중점적으로 관심있어 하는 DNA 서열 조각을 수백만배 증폭시키는 기술이다. 이는 1983년 Kary Mullis라는 과학자가 발명해낸 기술로 이는 아직까지도 많은 사람들이 자신들이 원하는 특정 서열을 증폭시키는데 사용하여 분자생화학에 있어서 매우 필수적인 기술이라고 할 수 있다.PCR을 진행하기 위해서 필요한 재료들이 여러가지가 존재한다. PCR을 하기 위해서는 우선 증폭하려고 하는 DNA template과 target region이 필요하다. 그리고 이 region 양 끝에 각각 상보적으로 결합할 수 있는 primers들이 두 개 필요하다. 이 primers는 DNA가 분리된 후 생성된 single strand에 각각 붙게 된다. 이 primers는 이후 DNA polymerase가 주형가닥을 이용해 상보적 서열을 합성하기 위한 시작점을 제공해준다. 이때 사용하는 polymerase는 heat-resistant를 가지는 Taq polymerase가 주로 이용되는데 이는 PCR이 높은 온도의 cycling에 의존하기 때문에 높은 온도에서도 변성이 일어나지 않는 효소를 이용하는 것이다. 이것과 더불어 마지막으로 DNA 합성의 기본단위인 dNTPs가 필요하다.PCR과정은 Initialization, Denaturation, Annealing, Elongation으로 이루어져 있는데 이 사이클이 주기적으로 계속 반복되어 많은 복제 서열들이 생겨나게 되는 것이다. 먼저 Initialization은 95도로 5분간 열을 가해주는 단계로 DNA polymerase가 heat activation되게 하는 단계이다. 다음 Denaturation에선 95도로 30초간 열을 가해주는데 이 온도에서 DNA의 상보적인 결합들은 분리가 된다. Annealing step은 60도를 30초 정도 가해주는 단계이고 이때 primers는 각각 단일 서열 가닥에 상보적으로 결합한다. 이 primers는 앞서 언급했듯이 DNA polymerase가 개시하기 위한 시작점이 된다. Elongation step은 다시 온도를 72도로 높이고 30초간 유지하는 단계로 DNA polymerase의 활성을 최대화하는 단계이다. 이 DNA polymerase는 dNTPs를 이용해서 새로운 가닥을 상보적으로 결합해 나간다. Initialization을 제외한 뒤 세단계는 한번 진행되면 연구자가 target한 부위의 수가 2배로 불어나는데 이를 여러 번 cycle로 반복하여 DNA를 증폭시킨다. 이후 Final elongation 단계를 72도에서 5분간 가해주어 남아있을 수 있는 단일 가닥 DNA를 모두 이중가닥으로 합성한다. 이후, 기계의 온도를 4도로 내려 마무리한다.ReferenceAndrew V. Anzalone, Peyton B. Randolph, et al., Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA, Nature, Vol. 576, 149-157, 2019Barrangou R., The roles of CRISPR-Cas systems in adaptive immunity and beyond, Curr Opin Immunology,32:36-41,2015

자연과학| 2023.03.14| 5페이지| 1,000원| 조회(330)

유전공학, 유전학, 유전자조작, CRISPR, genome editing

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[유전학] DNA sequencing, vector의 제작, NGS 평가A+최고예요

DNA sequencing, vector의 제작, NGSSummarize the sequencing processDNA는 단백질을 암호화 하고있는 물질로 A,T,G,C라는 기본 단위로 이루어진다. 어떤 서열을 갖고 있는 지에 따라 결과적으로 생산되는 단백질이 달라지게 되는데 이 서열을 확인하는 것은 분자생물학에 있어서 큰 의미가 있다. DNA sequencing은 그 DNA 서열을 확인하는 방법이다. 과거에는 그 방법으로 sanger method를 사용했지만 현재는 더욱 빠르고 신속하게 원하는 DNA서열을 확인할 수 있는 방법인 NGS를 통해 염기서열을 확인한다.이러한 서열분석방법과 함께 우리는 여러가지 생물학적 효소들을 이용해서 DNA를 우리의 입맛대로 재조합할 수 있는 기술을 가지게 되었다. 그 중하나가 바로 재조합 plasmid를 이용하는 방법인데 plasmid는 박테리아가 가지고 있는 작은 원형 DNA이다. gDNA와 다르게 plasmid는 박테리아가 옵션으로 가지고 있는 유전체라고 볼 수 있고 이는 박테리아에 넣기 쉽다는 특징이 있다. 우리는 DNA 재조합 기술을 이용해 이 plasmid를 조금 변형하고 이를 박테리아에 넣는다면 특정 옵션이 추가된 박테리아를 생산할 수 있다.본 보고서에서는 분자생물학에서 가장 핵심적인 기술이라고 할 수 있는 유전자 증폭기술은 PCR과 더불어서 plasmid를 재조합하는 과정, 이를 박테리아에 넣어주는 과정, 그리고 이를 배양하고 그 안의 plasmid를 뽑아내어 이를 sequencing하는 기술에 대해서 설명하도록 하겠다.먼저 PCR에 대해서 설명하면 PCR은 매우 간편한 유전자 증폭기술이다. 이 기술은 1983년 Kary Mullis라는 생화학자가 개발한 방법으로 현재까지도 유전자 서열을 증폭시킬 때 많이 사용되는 방법이다. 이를 위해서는 여러가지 재료가 필요하다. 먼저 증폭하고자 하는 DNA 서열이 있어야하고 증폭을 원하는 구간을 실험자가 설정해야한다. 그리고 이렇게 설정한 구간의 양끝에 붙을 수 있는 primer와 서열을 복제해 나갈 DNA polymerase가 필요하다. 마지막으로 서열 그 자체가 될 dNTP를 추가해주면된다. PCR과정은 온도를 바꿔주며 진행되며 온도가 변함에 따라 target DNA는 분리되고 polymerase에 의해서 복제되는 과정이 반복되어 증폭되게 된다.PCR을 통해서 우리가 넣어주고자 하는 서열을 선택적으로 증폭할 수 있다. 이제 이것을 plasmid에 넣어주어야하는데 그전에 Gel extraction 과정을 통해서 증폭한 DNA만을 분리할 필요가 있다. 이때 이용하는 방법이 electrophoresis이다. 특정 부분만을 증폭했다면 그 부분에 해당하는 일정한 fragment들이 모여있을 것이라고 생각할 수 있고 electrophoresis를 통해서 쉽게 분리해낼 수 있을 것이다. DNA를 분리하기 위한 electrophoresis에서는 아가로스 겔을 사용하도록 하고 phosphate때문에 (-) charge를 띠는 DNA의 특성을 이용하여 전류를 흘려주도록 한다. 이를 통해 우리가 원하는 부분만의 DNA fragment를 얻도록 한다.이후 이것을 벡터 plasmid에 삽입하여 재조합 plasmid를 만든다. 이 과정을 ligation이라고 부르는데 이는 DNA ligase 효소에 역할이 중요하다. Ligase는 DNA의 끊어진 조각들을 phosphodiester 결합으로 만들어주는 역할을 하고 이는 재조합 plasmid 제작에 있어서 필수적이다. Ligase 효소와 함께 이 작업에서 중요한 요소가 있는데 바로 restriction enzyme이다. 우리는 벡터에 우리가 원하는 fragment를 삽입하고자 하는데 그 틈을 만들어주는 것이 바로 restriction enzyme이다. 즉 우리는 restriction enzyme을 통해 벡터 DNA를 절단하고 ligase와 함께 목표 fragment를 넣어주어 삽입되도록 하는 것이다. 보통 작업을 도와주는 kit를 이용하여 진행한다.이제 이 plasmid를 대장균에 넣어주는 transformation 과정을 거친다. 대장균은 매우 빠르게 증식하기 때문에 많은 양의 plasmid를 추가적으로 얻을 수 있다. 이 과정에서는 인위적으로 세포벽을 약하게 만든 plasmid를 이용한다. 대장균을 plasmid와 섞으면 plasmid가 세포벽에 붙게되는데 이후 인큐베이션을 시키면 세포벽에 구멍이 뚫리게 되고 plasmid가 들어가게 된다. 이후 회복을 위해 얼음에 넣고 세포막이 회복되도록 기다린다.이제 대장균을 배양하여 colony를 생성하고 수를 불린다. 배지에 여러가지 흰색 푸른색을 띠는 colony가 나타난다. 여기서 흰색 colony가 바로 우리가 원하는 plasmid가 정상적으로 삽입된 colony이다. 이는 plasmid속의 Lacz라는 효소를 이용한 방법인데 이 효소는 lactose를 분해하여 푸른색을 나타낸다. 만약 우리가 원하는 fragment가 plasmid 속으로 적절히 들어가고 이것을 대장균이 가지고 있다면 Lacz효소를 적절히 발현할 수 없어 흰색 colony를 나타내게 되는 것이다. 추가적으로 아예 plasmid가 들어가지 않은 대장균은 plasmid의 항생제 내성 유전자가 없기 때문에 ampicillin을 이용하여 제거한다.마지막으로 이 plasmid를 extraction하는 방법이 prep이다. 이 과정도 kit를 이용해서 진행하게 되는데 기본적인 원리는 다음과 같다. 세포의 cell wall과 membrane을 부수고 Chromosomal DNA와 Plasmid DNA를 분리하여 최종적으로 plasmid만 얻어내는 것이다. 우선 bacteria culture를 tube에 넣고 원심분리하여 상층액은 버린다. 이후 RNase가 들어있는 FAPD1 buffer를 넣고 pipetting을 통해 cell을 다시 resuspend시킨다. 다음 FAPD2 buffer를 넣고 조심스럽게 invert하여 cell을 lyse하고 incubation한다. 이후 FAPD3 buffer를 넣고 5분간 원심분리한다. 이후 상층액을 FAPD column에 로딩하고 30초간 원심분리하여 column을 통과한 물질들은 제거한다. 이후 washing과정을 거쳐 우리가 원하는 plasmid만 남긴다. 마지막으로 elution buffer을 넣고 원심분리하여 pure plasmid DNA를 얻도록 한다.이렇게 얻어낸 plasmid는 이후에 sequencing을 하여 좀더 알아볼 수 있는데 이는 업체에 맡겨서 할 수 있다.Search for one example of Next Generation Sequencing(NGS)DNA의 염기서열을 sequencing하는 방법으로 Sanger sequencing method가 완전 자동화되어 사용되어 왔지만, 한 bp씩 차이가 나는 DNA 분자들을 모두 합성해야하고 이를 전기영동을 통해 분리하고 마지막으로 형광분석까지 해야하기 때문에 효율적이지 못한방법이다. 이러한 한계를 극복하고 더 효율적이고 빠른 DNA sequencing 방법이 나오게 되는데 바로 Next Generation Sequencing(NGS)이다. 여러가지 방법이 있는데 그중 가장 많이 사용되는 방법 중 하나가 Illumina sequencing이다.실험방법은 먼저 순수한 샘플을 얻고 그것을 amplify 시키는 과정에서 시작된다. 먼저 순수한 DNA를 얻고 이 DNA는 fragment화 되고 adaptor라고 불리는 작은 segment를 양쪽 끝에 붙이게 된다. 이 과정은 PCR을 통해서 이루어지고 이 부분은 이후 amplify, sequence, analyze과정에서 표지 역할을 해준다. 이렇게 변형된 DNA는 flow cell이라고 불리는 이 회사에서 개발한 작은 슬라이드 유리에 붙인다. Flow cell에는 adaptor와 상보적인 뿌리 역할을 해줄 수 있는 oligonucleotides들이 여러 개 붙어있기 때문에 각각의 fregment들에 존재하는 adaptor는 flow cell에 붙게 되고 bridge 형태를 이루게 된다. 이후 bridge amplication PCR이라는 PCR 일종의 과정을 통해서 증폭시킨다. 새로 합성된 가닥은 풀어져서 다시 PCR과정을 반복하게 되는데 이렇게 증폭시키면 1000개 정도의 동일한 fragments 들이 하나의 cluster을 이루게된다. 이후 한쪽 가닥은 모두 없애고 나머지 한쪽 가닥을 통해서 염기를 분석하게 된다.이후 sequencing을 진행한다. 이때 사용하는 염기는 형광으로 라벨링된 염기이다. 이 염기는 한번에 하나씩만 DNA에 달라 붙게되는데 그렇기 때문에 1bp가 붙을 때마다 형광을 분석하여 어떤 염기가 붙었는지 확인하고 염기 서열을 확인할 수 있다.ReferenceMartin K., Patricia H., Janet K., Addressing challenges in the production and analysis of illumina sequencing data, BMC Genomics, 12, 382,(2011)FavorPrep Plasmid DNA Extraction Mini Kit, FAVORGEN BIOTECH CORP., v.0912Malcolm J. C., Joany C., Stanley N. C., In vitro gene fusions that join an enzymatically active beta-galactosidase segment to amino-terminal fragments of exogenous proteins: Escherichia coli plasmid vectors for the detection and cloning of translational initiation signals, J. Bacteriol., 143, 2, 971-980, 1980

자연과학| 2023.03.14| 5페이지| 1,000원| 조회(236)

PCR, 플라스미드, DNA, 유전자, 벡터, 서열분석

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