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생태학실험 - 클로로필a(chlorophyll a) 농도 측정 및 분석 실험 레포트

충남대학교 생명시스템과학대학2024 생태학 실험 보고서영탑지와 반석천의 Chlorophyll a 농도 분석실험일시: 년 월 일보고서 제출일: 년 월 일제출자: 학번이름Ⅰ. Introduction호소의 부영양화란 정체된 수계(호소, 댐, 저수지)에서 영양 수준이 높아지고, 질소와 인과 같은 조류의 성장에 필요한 영양소 농도가 증가하여 식물성 플랑크톤이 대량으로 증식하게 되는 현상을 말한다. 이로 인해 생태계의 생산과 소비 간 균형이 파괴되며, 이렇게 대량으로 생산된 수생식물이 유기 오염물질로 작용하여 수질이 악화된다. 이는 호소 수질 저하의 가장 일반적인 형태로 나타난다. 호소 생태계에서 조류는 매우 중요한 기초 생산자로서 호소의 생산력에 큰 영향을 미친다. 조류의 생산력은 탄소, 질소, 인에 의해 크게 좌우되는데, 일반적으로 호소의 생산력은 인의 농도에 의해 주로 조절되기 때문에, 유입되는 인의 양이 부영양화 정도를 결정하는 1차적인 요소가 된다(김재윤, 1998).부영양화는 자연적 부영양화와 인위적 부영양화로 구분할 수 있다. 자연적 부영양화는 암석의 풍화, 바람에 의한 물질 이동, 지표수의 유입, 그리고 수체 내부 생물 활동 등에 의해 영양염류가 자연스럽게 증가하는 현상을 의미하며, 이 경우 영양염류의 증가가 느리고 상대적으로 천천히 진행된다. 반면, 인위적 부영양화는 인간 활동에 의해 발생하는 가정 하수, 공장 폐수, 축산 분뇨, 화학 비료 등의 유입으로 인해 영양염류가 급격히 증가하면서 자연의 자정 능력을 초과해 매우 빠르게 진행된다. 이러한 부영양화로 인해 식물성 플랑크톤이 과도하게 번식하게 되면, 용존산소가 감소하고, 수면으로 햇빛이 유입되는 것을 차단하는 등의 문제를 일으켜 생태계와 수질에 부정적인 영향을 미치게 된다(이보람, 2022).호수의 영양 상태를 평가할 때 주로 사용하는 항목은 조류 증식의 잠재적 요인인 영양물질(인, 질소), 조류의 현존량(Chlorophyll a), 그리고 그에 따른 결과를 반영하는 투명도로 나눌 수 있다(Kim, B 조류의 현존량을 나타내는 우수한 지표로서 많은 환경 선진국에서 사용하고 있다Chlorophyll a는 조류의 광합성에서 주요한 역할을 하는 색소이다. 이 색소는 가시광선 영역에서 특정 파장의 빛을 흡수하여 에너지를 얻는다. 분광광도법(spectrophotometric method)은 시료가 특정 파장의 빛을 흡수하는 양을 측정하는 방법으로, 본 실험에서는 chlorophyll a의 농도를 측정하기 위해 이 방법을 사용하였다. 이 방법에서는 특정 파장의 빛을 시료에 투과시킨 후, 시료가 얼마나 많은 빛을 흡수했는지 측정한다. 분광광도법을 통해 chlorophyll a를 측정할 때는 보통 아세톤이나 메탄올 혹은 에탄올과 같은 용매를 사용하여 엽록소를 추출하고, 추출된 용액의 흡광도를 특정 파장에서 측정한다. Trichromatic method는 chlorophyll a를 포함한 엽록소를 분리하지 않고, 총 엽록소 농도를 측정하는 방법이다. 이 방법은 여러 가지 엽록소 형태가 혼합된 용액에서 chlorophyll a, b, 그리고 carotenoids 등 다양한 색소의 흡광도를 동시에 측정하여, 각 색소의 농도를 계산한다. 이 방법에서는 3개의 주요 파장에서 흡광도를 측정하며, 본 실험에서는 시료를 각각 649, 665, 750 nm에서 측정하였다. 649 nm는 chlorophyll b의 흡광도가 높은 영역이므로, 혼합 시료에서 chlorophyll a와 b의 농도를 분리하여 추정할 수 있다. 이 파장을 사용하여 chlorophyll b의 영향을 보정하거나 제거할 수 있다. 665 nm에서는 chlorophyll a의 흡광도가 가장 크며, 이 파장에서 엽록소가 주로 빛을 흡수한다. 이 흡광도를 통해 chlorophyll a의 농도를 정확히 측정할 수 있다. 750 nm는 엽록소의 흡광에 큰 영향을 받지 않는 파장대이다. 이 파장은 기저선 보정(baseline correction)을 위해 사용된다. 750 nm에서의 흡광도 값은 주로 용매, 시료 처리 시 발생하는 값을 나타내며, 산출된 CHL-a 농도의 단위는 μg/L이다. 이 식에서 OD665 - OD750은 665 nm의 흡광도에서 750 nm의 흡광도를 뺌으로써, 엽록소 외의 간섭 요소에 의한 영향을 제거하기 위함이다. 750 nm는 엽록소가 거의 흡수하지 않는 파장대인 배경 노이즈이다. 따라서 665 nm와 750 nm의 흡광도 차이를 계산하면 chlorophyll a의 순수 흡광도만을 추출할 수 있다. OD649 - OD750에서 649 nm는 chlorophyll b의 최대 흡수 파장이며, 마찬가지로 750 nm에서의 흡광도를 뺌으로써 배경 흡광도를 제거할 수 있다. 식에서 13.7과 5.76은 각각 Chlorophyll a와 Chlorophyll b의 흡광 계수(absorptivity coefficient)를 나타낸다. 이를 통해 chlorophyll a와 b의 상대적인 농도 비율을 반영하여 chlorophyll a의 순수 농도를 계산할 수 있다.Trichromatic method는 시료 내의 여러 색소의 농도를 동시에 계산할 수 있기 때문에 분석 속도가 빠르고 간편하다. 또한, 엽록소의 종류가 정확히 알려져 있고, 흡광도가 겹치는 파장에서 각 색소의 흡광도가 충분히 구분될 때는 신뢰할 수 있는 값을 제공한다. 하지만 chlorophyll a와 b, 그리고 carotenoids는 흡광 스펙트럼이 일부 겹칠 수 있으며, 용매의 종류에 따라서 엽록소의 흡광도 값이 달라질 수 있다. 또한, pheophytin은 chlorophyll이 분해되거나 산성 환경에서 엽록소 중심의 마그네슘 이온이 떨어져 나가면서 생성되는 화합물로, chlorophyll a와 유사한 흡광 스펙트럼을 가지고 있기 때문에 농도 측정 시 혼동을 일으킬 수 있다. 위 방법을 사용하게 될 경우 pheophytin의 보정이 없어서 시료에 pheophytin이 존재하면 chlorophyll a의 농도가 실제보다 과대평가될 수 있다.이번 실험은 영탑지와 반석천에서 직접 채수한 시료를 이용하여 분광광도5-13 인근)에서 2L 채수병에 부유물이 들어가지 않도록 조심히 물을 가득 채운다.2. 각 sample water을 메스실린더에 250ml 계량하여 진공펌프와 GF/C 필터를 이용하여 필터링 한다.3. 필터링 된 GF/C 필터를 말아 15ml 튜브에 넣는다.4. 필터가 있는 15ml 튜브에 95% 에탄올 7.6ml을 넣는다.5. 이 같은 과정을 반복하여 증류수 2개, 반석천 2개, 영탑지 2개, 총 6개의 sample tube를 준비한다.6. water bath에 튜브가 잠길 정도로 물을 넣고 73℃에서 20분간 heating 한다.7. heating 후 암실에서 2시간 보관한다.8. 2시간 후 tube를 3회정도 가볍게 흔들어 준 뒤 3000rpm에서 2분간 원심분리한다.9. 649nm, 665nm, 750nm에서 흡광도를 측정한다. 영탑지 채수지점(대전 유성구 대학로 99)Ⅲ. Results 반석천 채수지점(장대동 315-13 인근)과 는 채수 당일 촬영한 채수 지점의 사진과 해당 지점을 지도상에 표시한 것이다. 육안으로 확인한 결과, 영탑지는 수질이 매우 탁하여 가까운 거리에 있는 돌의 형상만을 관찰할 수 있었으나, 반석천은 수질이 깨끗하여 바닥면이 명확하게 관찰되었다.흡광광도계를 이용하여 6개의 샘플의 OD 값을 측정하였다. 95% 에탄올을 사용하여 blank를 측정한 결과 -0.001이 나왔다. 첫 번째 증류수 샘플의 OD 값은 649nm, 665nm, 750nm에서 각각 0.034, 0.034, 0.033이었고, 두 번째 증류수 샘플의 값은 각각 0.005, 0.005, 0.005였다. 첫 번째 반석천 샘플은 649nm, 665nm, 750nm에서 각각 0.010, 0.013, 0.009의 값을 보였으며, 두 번째 반석천 샘플의 값은 각각 0.002, 0.006, 0.002였다. 첫 번째 영탑지 샘플의 OD 값은 649nm, 665nm, 750nm에서 각각 0.039, 0.084, 0.009이었고, 두 번째 영탑지 샘플은 각각 0.041, 0.09 데이터를 보면(표 1), 영탑지에서 채수한 두 샘플은 각각 25.98 μg/L와 33.15 μg/L의 Chlorophyll a 농도를 보였고, 반석천 샘플은 1.49 μg/L와 1.66 μg/L의 농도를 나타냈다. 이는 영탑지의 수질이 영양소 농도가 높고 조류가 과도하게 번식하여 수질이 좋지 않은 상태임을 나타내며, 반석천은 상대적으로 수질이 양호한 상태임을 보여준다. 증류수 샘플에서는 Chlorophyll a가 거의 검출되지 않았다. 영탑지의 높은 Chlorophyll a 농도는 수체 내 영양소가 풍부하여 식물성 플랑크톤이 많이 증식했음을 의미한다. Chlorophyll a의 주요 역할이 식물성 플랑크톤의 광합성을 돕는 것이기 때문에, 농도가 높을수록 식물성 플랑크톤의 농도가 높아짐을 의미하며, 이는 영탑지가 조류의 과도한 증식으로 인해 수질이 악화된 상태임을 시사한다. 반면, 반석천에서의 낮은 chlorophyll a 농도는 해당 수체가 비교적 깨끗한 상태에 있음을 보여준다. 이는 이는 물이 흐르는 하천 특성상 영양소가 축적되지 않고 지속적으로 순환되기 때문일 수 있다.영탑지에서 측정된 chlorophyll a 농도가 매우 높게 나타난 것은 여러 가지 요인이 있을 수 있다. 수체에 공급된 영양염류는 식물성 플랑크톤이나 조류가 성장하고 번식하는데 필수적인 물질이다. 영양염류를 흡수한 조류(또는 식물성 플랑크톤)은 빠르게 번식하며 이 과정에서 1차 생산이 활발하게 이루어진다. 조류가 성장한 후, 조류가 죽거나 다른 생물에 의해 먹히면서 생체 내 축적된 영양염류가 다시 방출된다. 이때 방출된 영양염류는 다음 두가지 경로로 재순환된다. (1) 바닥 슬러지 및 세균 분해 : 죽은 조류가 바닥으로 가라앉으면서 침전성 유기물(슬러지)을 형성한다. 이 슬러지는 바닥에 쌓이면서 세균에 의해 분해되고, 분해되는 과정에서 다시 무기물(질소, 인 등) 형태의 영양염류가 방출된다. (2) 용존 상태의 영양소 : 조류가 죽을 때 바로 물속으로 영양소가 방출되면, 물에 녹아 용존 .

자연과학| 2025.05.29| 7페이지| 2,500원| 조회(82)

엽록소, 클로로필, 클로로필a, 생태학실험

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생태학 실험 - 총인분석(TP) 실험 레포트(M&M, Standard curve, 결과분석 자세함)

충남대학교 생명시스템과학대학2024 생태학 실험 보고서에서총인 분석 실험실험일시: 년 월 일보고서 제출일: 년 월 일제출자: 학번이름Ⅰ. Introduction총인총인(TP, total phosphate)은 시료 내 모든 인 화합물의 합계를 의미하며, 하천의 수질 환경 기준으로 사용되며, 인은 질소와 함께 부영양화를 유발하는 주요 영양염류로 적조 현상의 원인이 되기도 한다. 인의 공급원으로는 생물의 분해, 공장 폐수, 가정 하수 등이 있으며, 수중에 있는 인 화합물은 미생물 활동이나 화학적 반응에 의해 정인산, 메타인산, 파이로인산, 폴리인산과 같은 무기 인산염과 농약, 에스터, 인지질 등의 유기인 화합물로 쉽게 변환된다. 이러한 다양한 형태의 인 화합물은 각각 상이한 물리·화학적 특성을 가지므로, 정확한 측정을 위해서는 적절한 전처리 과정이 필수적이다(Murphy & Riley, 1962).처리 과정에서 축합인산과 유기인 화합물은 서서히 분해되어 측정이 어려운 경우가 많기 때문에, Postassium persulfate(과황산칼륨)으로 환원시켜 이를 인산염으로 전환한 후 측정한다. 총인 측정법은 모든 인 화합물을 인산염(PO₄) 형태로 변화시킨 다음 아스코르빈산 환원 흡광광도법으로 정량하여 총인의 농도를 계산하는 방식이다. 이 과정은 수질 내 인 농도를 정밀하게 분석함으로써 부영양화 문제를 사전에 예측하고 대응하는 데 기여한다.흡광광도법흡광광도법에는 염화제일주석 환원법과 아스코르빈산 환원법 두 가지가 있으며, 염화제일주석 환원법은 인산 이온이 몰리브덴산 암모늄과 반응하여 몰리브덴산 인 암모늄을 형성하고 이를 염화제일주석으로 환원시켜 생성된 몰리브덴 블루의 흡광도를 690nm에서 측정하여 인산염을 정량하는 방법이고, 아스코르빈산 환원법은 같은 몰리브덴산 인 암모늄을 아스코르빈산으로 환원하여 880nm에서 흡광도를 측정하여 인산염 농도를 정량하는 방법이다. 두 방법 모두 인 농도의 정확한 측정을 위해 널리 사용되며, 특히 아스코르빈산 환원법은 더 넓은 파장에서의이 시약은 몰리브덴 블루의 색상 반응을 촉진하여 인 농도의 민감도를 높인다. (4) H₂SO₄(Sulfuric Acid, 황산): 황산은 강산으로, 용액의 pH를 조절하고 반응을 안정화시키는 역할을 한다. 황산은 용액을 산성으로 만들어 몰리브덴산 암모늄과 인산염이 효과적으로 반응할 수 있게한다. (5) Ascorbic Acid (아스코르빈산): 아스코르빈산은 몰리브덴산 인 암모늄을 '몰리브덴 블루'로 환원시키는 환원제이다. 환원된 몰리브덴 블루의 흡광도를 880nm에서 측정하여 인산염의 농도를 알 수 있다. (6) Potassium Persulfate (과황산 칼륨): 과황산 칼륨은 인 화합물을 분해하여 분석 가능한 인산염 형태로 전환하는 역할을 한다. 이를 통해 실험에서 측정할 수 있는 무기 인산염으로 변환하여 정확한 결과를 얻을 수 있다.실험 목표이 실험의 목적은 하천 및 호수 등의 수계에서 총 인(Total Phosphate, TP) 농도를 측정하여 수질 오염 수준을 평가하고, 이를 통해 부영양화와 같은 환경 문제를 사전에 예측하고 대응할 수 있는 기초 데이터를 확보하는 데 있다. 인은 질소와 함께 수생 생태계에서 주요한 영양염류로 작용하며, 과도하게 공급될 경우 조류의 과성장을 유발하여 녹조 및 적조와 같은 부영양화를 초래할 수 있다. 부영양화는 용존 산소의 급격한 감소를 야기해 어류와 수생 생물의 생존을 위협하며, 생물 다양성 감소와 같은 심각한 생태적 문제를 일으킨다. 본 실험에서는 KH₂PO₄를 활용하여 표준 용액을 제조하고, 아스코르빈산 환원법을 사용해 몰리브덴 블루의 흡광도를 측정함으로써 시료 내 총 인 농도를 정밀하게 분석한다. 이를 통해 반석천과 영탑지에서 채취한 샘플의 인 농도를 비교 분석하여, 해당 지역의 수질 상태를 파악하고 나아가 환경 보전과 오염 방지 전략 수립에 기여할 수 있는 기초 자료를 제공하는 것이 이 실험의 주요 목적이다.Ⅱ. Materials and Methods1. Materials(1) 시약KH2PO4(Potassiu.9ml을 넣어서 최종 농도가 40ug/L인 100ml standard solution dilution을 만든다.비커에 stock solution 0.2ml 과 DW 99.8ml을 넣어서 최종 농도가 80ug/L인 100ml standard solution dilution을 만든다.비커에 stock solution 0.5ml 과 DW 99.5ml을 넣어서 최종 농도가 200ug/L인 100ml standard solution dilution을 만든다.비커에 stock solution 1.0ml 과 DW 99ml을 넣어서 최종 농도가 400ug/L인 100ml standard solution dilution을 만든다.표 1. Standard solution dilution 농도농도stock solutionDWtotal volume20ug/L0.05ml99.95ml100ml40ug/L0.1ml99.9ml100ml80ug/L0.2ml99.8ml100ml200ug/L0.5ml99.5ml100ml400ug/L1ml99ml100ml(3) TP Color Reagent 제조- 혼합 플라스크에 1,000ml DW를 넣는다.- 15g Amomonium molybdate을 넣는다.- 0.34g Potassium Antimony Tatrate을 넣는다.- 100ml DW로 weight dish의 시약 잔여분을 wash하여 첨가한다.- 140ml H2SO4를 첨가한다.- 혼합 플라스크 입구를 파라필름으로 봉하고 뚜껑을 덮은 후 잘 흔들어 섞어준다.- 완전히 녹인 후 DW를 넣어 total 2,000 ml으로 맞춘다.(4) 본 실험- 반석천과 영탑지에서 각각 Sample water을 채수한다.- 채수한 sample water을 4℃에서 보관한다.- 30ml tube에 Standard solution을 농도별로 각각 25ml씩 분주한다.- 반석천 sample water을 3개의 tube에 각각 25ml씩 분주한다.- 영탑지 sample water을 3개의 tube에 각각 25ml씩 분00.3290.3070.318는 standard solution의 흡광도 측정 값을 나타낸다. Standard carve의 신뢰도를 높이기 위해 1조와 2조의 흡광도 값을 각각 구한 뒤 평균을 내어 사용한다.은 를 토대로 만들어진 Standard curve 이며, Standard solution의 200와 400의 값은 사용하지 않고 작성되었다. x축은 농도(단위는 생략됨)를, y축은 흡광도를 나타낸다. 추세선은 y=0.0007x+0.0575 이며, 결정계수(R^2) 값은 0.999로, 농도와 흡광도 사이의 높은 선형 관계를 나타낸다.표 3. 반석천과 영탑지의 TP 농도(ug/L)ABS 880nmTP (ug/L)반석천10.09553.57142857반석천20.09553.57142857반석천30.09350.71428571영탑지10.07119.28571429영탑지20.07119.28571429영탑지30.07220.71428571< 표 3>은 의 추세선에 흡광도를 대입하여 각 반석천 샘플과 영탑지 샘플의 TP 농도를 구한 결과이다. 반석천 1과 반석천 2는 53.57142857 ug/L 이며, 반석천 3은 50.71428571 ug/L를 나타낸다. 영탑지 1과 영탑지 2는 19.28571429 ug/L, 영탑지 3은 20.71428571 ug/L 의 TP 농도를 나타내었다. 이때, 총인의 단위는 표준 용액의 단위인 ug/L을 준용하여 설정되었다. 이를 mg/L로 변환한 총인 농도를 아래의 에서 나타내었다.표 4. 반석천과 영탑지의 TP 농도(mg/L)TP(mg/L)반석천10.0536반석천20.0536반석천30.0507영탑지10.0193영탑지20.0193영탑지30.0207의 TP 농도(mg/L)는 소수점 다섯째자리에서 반올림 하여 나타내었다. 반석천 1과 2는 0.0536 mg/L, 반석천 3은 0.0507 mg/L 의 TP 농도를 나타낸다. 영탑지 1과 영탑지 2는 0.0193mg/L, 그리고 영탑지 3은 0.0207 mg/L의 TP 농도를 나타낸다.Ⅳ. Discus 농도가 과도하게 높아질 경우 조류의 과잉 번식이 일어나 물이 탁해지고 악취가 발생할 뿐만 아니라 식수 및 여가 용도의 활용에도 장애가 된다고 알려져 있다. 그러나 본 실험에서 영탑지에 비해 높은 총인 농도가 나타난 반석천의 경우 흐르는 하천이며, 육안으로 보기에도 비교적 영탑지에 비해 맑은 수질을 보였다. 이러한 결과가 도출된 까닭에 대해 논의해보고자 한다.클로로필-a는 식물성 플랑크톤의 주요 색소로, 수중의 조류(algae) 양을 간접적으로 나타내며, 조류 번성을 통해 부영양화를 평가하는 중요한 지표로 사용된다. 총인은 호소의 영양 상태를 결정하는 중요한 영양소 중 하나로, 클로로필-a 농도와 관련이 있다. 일반적으로 총인 농도가 높을수록 클로로필-a 농도가 증가하는 경향이 있다. 이는 총인이 조류 성장에 필요한 주요 영양소이기 때문이다. 호소에 총인 농도가 높아지면 조류가 이를 영양소로 사용하여 빠르게 번식하게 되고, 그 결과 클로로필-a 농도도 상승하게 된다(Smith, 1982). 여러 연구에 따르면 총인과 클로로필-a는 선형 관계를 보이는 경우가 많으며, 총인 농도가 호소에서 클로로필-a 농도를 예측하는 중요한 지표로 사용되기도 한다.는 지난 실험(2024.10.03)에서 직접 측정한 반석천과 영탑지의 클로로필 a의 농도를 나타내고 있다. 반석천의 클로로필 a의 평균 농도는 1.57835 ug/L이며, 영탑지의 클로로필 a의 평균 농도는 29.56795 ug/L 이다. 에서 반석천과 영탑지의 총인 농도를 평균내면 각각 52.61905 ug/L, 19.7619 ug/L 이다. 클로로필 a의 농도는 영탑지에서 매우 크게 도출된것에 반해 총인 농도는 반석천에서 더욱 높게 도출되었다. 총인 농도는 호소 내에 존재하는 인의 전체 양을 나타내지만, 이 중 조류가 실제로 이용할 수 있는 인의 양은 용존 무기 인산염(Dissolved Inorganic Phosphate)의 형태로 존재하는 부분에 한정된다. 따라서 총인 농도가 높다고 해서 모든 인이 조류 성장에 기

자연과학| 2025.05.29| 10페이지| 2,500원| 조회(99)

총인, 총인실험, 생태학실험, 총인분석, 인분석

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유전 발생 생물학 실험 레포트 Cellular Senescence Immunofluorescence

충남대학교 생명시스템과학대학유전발생생물학 실험 보고서제목 : Cellular Senescence Immunofluorescence이름 :실험 일시 :보고서 제출일 :Ⅰ. Introduction1. DPP4 proteinDPP4(dipeptidul peptidase 4)는 다양한 장기와 세포에서 널리 발현되는 막 관통형 당단백질이다. DPP4는 혈장과 체액에서도 용해성 형태로 존재할 수 있다[1].또한 DPP4는 노화 세포의 바이오 마커로서 작용할 수 있다. DPP4는 노화된 인간 이배체 섬유아세포(human diploid fibroblasts)인 WI-38 HDF 의 표면에서 선택적으로 발현되는 단백질이다[2]. 증식 및 노화 WI-38 HDF 세포 표면에서의 DPP4 발현[2]에서 보는것과 같이 젊은 세포(P)에서는 DPP4가 염색되지 않은 것으로 보아 거의 발현되지 않았고, 노화 세포(S)에선 DPP4가 빨갛게 염색되어 발현함을 확인할 수 있다.또한 DPP4는 노화 세포는 항체 의존성 세포 매게 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)에 의해 우선적으로 제거되는데, 이는 에 나타내는 것처럼 세포 표면에 DPP4가 존재하기 때문에 항-DPP4 항체를 인식하는 NK cell에 의한 파괴의 표적이 되었기 때문이다[2]. ADCC 작용 기작[3] 노화 세포의 선택적 제거[2]즉 세포가 노화할수록 세포 표면의 DPP4가 증가하게 되는데 이는 ADCC에 의해 노화 세포를 선택적으로 제거하게 된다.ADCC는 암이나 바이러스가 감염된 타겟 세포를 용해하기 위한 면역세포의 활성화를 유도하는 세포 매게 면역 방어 매커니즘이다[3]. 이 경우에서는 타겟세포가 노화 세포로, NK cell이 세포 표면의 항-DPP4 항체를 인식하여 세포를 제거하는 것이다. 이러한 메커니즘을 이용해 노화 세포를 제거하게 된다.본 실험에서는 면역 형광 염색(Immunofluorescence) 방법을 이용하여 노화 세포와 증식 세포에서의 결합하는 방법이다. 비교적 저렴하고 2차 항체가 1차 항체에 결합만 한다면 2차 항체를 다양하게 사용할 수 있기 때문에 유용하지만 실험과정이 오래 걸리는 단점이 있다. 본 실험에서는 간접방법인 IIF를 사용하였다. IIF Method [4]항원 특이적 항체가 표면에 고정된 항원에 결합하도록 한 뒤형광 표지된 2차항체가 접합하며 이러한 복합체를 조사하여항원 특이적 항체를 검출하는데 이용한다.(3) 실험 이론 실험 Method 단계 모식도①Fixation첫 번째로, Fixation은 autolysis를 방지하고, 부패를 완화하며, 항원성을 유지하며 형태를 보존하기 위한 필수 단계이다. 이상적인 Fixation은 antibody가 antigen에 최대로 결합할 수 있도록 하는 것으로, epitope(antigen 표면에 있는 antibody 결합 부위)의 면역 활성을 보존하면서 동시에 다른 protien의 epitope를 분해하거나 masking 하는 것이다. 보편적인 fixation 은 없기 때문에 antigen 유형에 따라 최적의 fixation solution이 다르며 경험적으로 결정해야한다. 이러한 fixation solution은 크게 cross-linking reagents와 유기 용매가 있으며 별도로 사용하거나 조합하여 사용할 수 있다. 일반적인 예시로 corss-linking에는 폼알데히드, 글루타르알데히드가 있고, 유기 용매는 메탄올과 아세톤 등이 있으며 이들은 지질을(plasma membrane) 제거하고 세포를 탈수시켜 세포 성분을 변성 및 침전 시킬 수 있다[5].②PermeabilizationPermeabilization은 antibody가 cell 내부에 있는 antigen에 접근해야 하는 경우에 필요하다. 또한 antigen 이 세포 내부에 있는 경우에도 막 관통 단백질을 detection 하기위해 필요하다. fixation을 메탄올과 에탄올로 사용한 경우에는 이미 cell membrane이 없어졌기 때문에 생략할 수 있다.(하지만 메탄용해야 한다. 이 시약 또한 보편적인 방법론이 존재하지 않으므로 경험적으로 결정된다. 단백질 용액, 일반 혈청등이 존재한다. blocking solution의 예시로는 소 혈청 알부민, 무지방 분유, 젤라틴등이 있다[5].④,⑤ Antibody incubation and stainingtarget antigen에 대응하는 1st antibody 의 결합과 형광 표지가 되어있는 2nd antibody를 결합해주는 과정이다. 이때 사용하는 antibody는 mouse, rabbit, goat의 antibody를 사용하는 것이 일반적이다. 2nd antibody가 sample에서cross-reacting with endogenous immunoglobulins를 방지하기 위해 1st antibody는 sample의 antibody는 다른 종에서 유래한 것을 사용하는 것이 좋다[6].⑥Mounting형광 stain인 DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindol)를 이용한 염색방법이다. 푸른색의 형광을 detection 하여 염색된 부위를 볼 수 있다. 일반적으로 DNA를 염색할 때 사용하는 dye이나 핵을 관찰할때도 사용한다.Ⅱ. Materials and Methods1. Meterials기자재Incubator피펫&피펫팁타이머Para film형광 현미경Cover glass &Slide glassPetri dishes핀셋시약1X PBSformaldehyde0.2% Triton X-100 solution10% normal goat serum antibody10% normal goat serum 2ndantibodymounting solutionDAPIWI-38(humanfetal lung fibroblast)(가시광선이 들지않는 갈색 ep tube에 보관)본 실험에서는 소분된 시약을 사용하였고, 기자재를 직접 다루지 않았으나이해를 위해 일부 임의의 사진으로 대체하였음.2. Methodcover glass에 WI-38(humanfetal lung fibroS solution에 희석한 0.2% Triton X-100 solution을 5분간 반응시킨다. 이 과정은 표적 단백질이 세포 안에 존재할 경우 cell membrane에 구멍을 뚫어서 antibody가 표적 단백질에 결합할 수 있도록 하는 과정이다. 본 실험에서는 Triton X-100이라는 계면활성제를 이용하여 cell membranem에 투과성을 부여해주었다. 이때 타이머를 이용하여 정확한 시간동안 반응 시킨 뒤 cell을 킴테크 와이퍼로 옮겨 남은 solution을 suction하고 1X PBS로 한번 washing 해준다. ?다시 petri dish로 cell을 옮긴 뒤 10% normal goat serum을 cell에 add하고 4도에서 overnight 반응 시켜주었다. 이것은 Blocking 과정으로 2차 항체가 만들어진 염소의 혈청(serum)을 분주하여 원하는 항체만 specitic하게 붙을 수 있게 해주는 과정이다. 반응 뒤 남아있는 serum을 제거해 준다. ? 10% normal goat serum의 희석된 antibody를 200ul 각 slide에 add 한 뒤 1시간동안 37도 인큐베이션에서 반응시켰다. 각 cell을 킴테크 와이퍼로 옮기고 1X PBS로 5번 washing 한다.(2분 이상 반응시켰음) ? petri dish로 cell을 옮기고 10% normal goat serum의 희석된 2차 antibody를 200ul 각 slide에 분주한 뒤 30분동안 37도 인큐베이션에서 반응시켰다. 이때 2차 antibody가 빛에 민감하므로 시약을 넣어주자마자 빛이 통하지 않도록 박스 등에 담아 바로 인큐베이터에 넣어주어야 한다. 30분 후 킴테크 와이퍼에서 각 cell을 1X PBS로 5번 washing 하였다. 2차 antibody를 잘 제거해주어야 background noise가 적은 깨끗한 상을 관찰할 수 있으므로 washing에 주의한다. ? 마지막으로, 핵을 염색하기 위한 mounting solution(DAPI)을 . DPP4가 발현되어 빨갛게 관찰되었다. DAPI의 경우 파랗게 염색된 핵을 관찰할 수 있다. 마지막 사진은 DPP4와 DAPI를 병합한 것으로, 핵과 DPP4를 동시에 관찰하였다.Ⅳ. Discussion200 μm1. 결과해석본 실험은 노화 세포와 증식 세포에서의 DPP4 발현 차이를 형광 표지를 이용하여 육안으로 관찰하는 실험이다. 증식 세포에서는 DPP4가 거의 발현되지 않았다. 하지만 노화 세포에서는 증식 세포와 비교하였을 때 확연하게 빨간색 형광물질이 관찰되어 DPP4가 발현되었음을 확인할 수 있었다. 또한 노화세포에서는 DPP4 발현뿐만 아니라 세포와 핵의 크기가 커지게 되는데, 노화세포의 DAPI 관찰에서 증식 세포와 비교했을 때 핵의 크기가 커지는 것 또한 관찰할 수 있었다. 이 실험의 결과로 세포가 노화함에 따라 핵 크기의 증가 및 DPP4 발현이 촉진되는 것을 확인할 수 있었다.2. Immunofluorescence method utilizationThyroid autoimmune diseases(TAD, 갑상선 자가면역 질환)자가면역 질환은 자가 항원에 대한 병리적인 반응을 특징으로 한다. 즉 혈청 내에 자가 항체가 있는 경우 일반적으로 자가면역 질환으로 정의할 수 있다. 여기서는 IIF 기법을 이용해 Thyroid autoimmune diseases(TAD)에서 특이적으로 나타나는 항체를 염색하여 건강한 사람과 TAD 환자의 조직을 비교하는 실험을 나타내었다. TAD 질환의 특이적인 항체는 TGAbs(Thyroglobulin Autoantibodies, 갑상선 글로불린 자가항체)와 TMAbs(Thyroid Microsomal Autoantibodies, 갑상선 마이크로솜 자가항체)이다[5]. 갑상선 조직에 존재하는 자가항체(autoantibodies)[5]A) 건강한 사람의 갑상선 조직에서 나타나는 패턴 : 갑상선 세포의 세포질과 follicles 내부는 염색되지 않았지만, 갑상선 follicles 사이의 결합조직에서는 양성을 띄었다.(였다.

자연과학| 2024.04.03| 11페이지| 3,500원| 조회(193)

유발, Immunofluorescence, 면역형광, 노화세포

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유전 발생 생물학 실험 레포트 Cellular Senescence SA-B-gal staining

충남대학교 생명시스템과학대학유전발생생물학 실험 보고서제목 :Cellular Senescence SA-β-gal staining실험일시:보고서 제출일:제출자: 학번이름Ⅰ. Introduction1. 세포 노화(cellular Senescence) 정의 및 실험 원리노화(senescence)는 1960년대에 레너드 헤이플릭(Leonard Hayflick)과 풀 무어헤드(Paul Moorhead)라는 두명의 과학자에 의해 처음 발견되었다[1].이후 많은 연구자들이 세포 노화(cellular senescence)의 특징과 이를 유발하는 요인, 노화가 다른 세포와 신체 전체에 미치는 영향등 다양한 연구를 진행하며 활발히 연구되고 있다.세포 노화(cellular senescence)는 DNA손상, 텔로미어 기능 장애, 종양 유전자 활성화 및 세포기관 스트레스를 포함한 다양한 유발 요인에 대한 반응으로 발생한다[2].하지만 노화(senescence)가 항상 나쁜 것은 아니다. 세포가 stress를 받으면 암세포로 발전될 수 있는데, 세포 노화는 그런 세포의 세포 주기(cell cycle)을 정지시켜 손상된 세포의 증식을 막는다. 또한 cellular senescence cell은 세포질로 다양한 protein을 분비하게 되는데 이를 SASP(senescence-associated secretion phenotype, 노화 분비 표현형)이라고 한다. SASP는 cell의 환경등에 따라 다르며 cytokines, growth factor, proteases등이 있다. 이러한 protien은 식세포의 면역 세포(Phagocytic immune cell)들을 모아 손상된 조직을 복구하거나 세포 손상을 제거하는데 도움을 줄 수 있다[3].Senescence-associated beta-galactosidase (SA-β-gal)는 노화세포에 특이적으로 존재하는 효소로서, 기질인 X-gal을 청색을 띠는 물질과 단당류로 가수분해 한다. (Picture 1.) 나이가 들어감에 따라 S뿐만 아니라 세포가 크고 납작한 형태와 핵의 비정상적인 형태를 나타낸다. (Picture 2.)본 실험에서는 이러한 노화 마커를 이용하여 정상 세포와 노화 세포를 관찰하고자 한다.2. 연구 이유우리나라는 65세 이상의 노인이 전체 인구에서 차지하는 비율이 이미 2000년에 7%를 넘어, UN분류 기준에 따르면 고령화사회 (aging society)에 접어 들었으며, 출산율 저하 및 생존확률 증가, 기대수명 연장 등으로 인해, 2018년에는 고령사회 (aged society), 2026년에는 초고령사회 (post-aged society)에 접어 들 것으로 전망되고 있다[4]. 인간의 기대 수명이 늘어난다는 사실은 긍정적인 일이지만, 적절한 대처가 없다면 사회 전반적으로 부정적인 영향이 클 것이다. 실제로 국내 노인의 경우 사망하기 직전의 8년간을 심하게 아파 병차례를 하며 세월을 보낸다. 이 8년동안 사람은 자신의 의료비용의 95% 이상을 지출한다고 한다[5]. 2005년부터 2014년까지 Pubmed에 등록된 연구 논문을 대상으로 노화 관련 연구 논문들의 서지사항을 검색한 결과에 따르면, 노화 연구의 선두 주자는 미국으로, 전 세계의 연구 논문수의 38.4%를 차지하고 있으며, 이를 이어 영국, 일본, 독일, 캐나다, 프랑스 등이 뒤를 잇고 있다. 한국의 경우 노화 연구 실적은 500건 미만으로 전체 연구 역량의 1-2%에 머물고 있는 실정이다[6]. 따라서 국내 노화 연구의 발전이 필요하다고 생각한다.Ⅱ. Materials and Methods1. Materials기자재형광현미경6 well cell culture plate피펫&피펫팁코니칼 튜브incubatorpara film시약10X Fixative solution10X staining solution100X solution A,B1X PBS20mg/ml X-gal solution3차 증류수본 실험에서는 소분된 시약을 사용하였고, 기자재를 직접 다루지 않았으나이해를 위해 임의의 사진으로 대체하였음.2. MeTotal volume1000ul x 5(1) 시약준비Table 1. 1X Fixative solution 비율 Table 2. 1X Staining solution 비율위와 같은 비율로 용액을 제조하여 1X Fixative solution 5ml, 1X Staining solution 5ml을 만들었다.β-gal staining solution용액용량1X Staining solution930ul x 5100X solution A10ul x 5100X Solution B10ul x 520mg/ml X-gal solution50ul x 5Total volume1000ul x 5Table 3. β-gal staining solution 비율제조한 1X Staining solution 930ul와 100X solution A 10ul, 100X Solution B 10ul 및 20mg/ml X-gal solution 50ul를 각각 5배분량으로 제조하여 총 5ml의 β-gal staining solution을 제조하였다.1X Fixative solution은 세포를 관찰할 수 있도록 세포를 정지시켜주는 시약이며, β-gal staining solution은 인위적으로 반응을 시키기 위해 넣어준 기질 X-gal과 관찰을 용이하게 하기 위한 염색약을 포함한 시약이다.이때 β-gal staining solution이 빛에 민감하므로, 은박지로 용액 겉면을 감싸주어야 한다.(2) 실험 방법세포가 떨어져 나가지 않게 하기 위해 세포부착을 도와주는 특수한 플라스틱을 사용한 6 Well Cell Culture Plate를 사용하였다. proliferating cell(P)와 senescence cell(S)를 각각 2개의 well에 담았다.SS미사용PP미사용Table 4. cell well 모식도먼저 세포를 배양 시키기 위해 첨가되었던 배지를 모두 제거하였다. 1X PBS solution을 사용하여 모든 cell을 washing 하였다. 만들어둔 1X Fixative solut 넣어 washing 하였다. 이 과정을 두 번 반복하여 깨끗하게 washing 한 뒤 suction 하였다. 이 후 β-Galactosidase Staining Solution을 각 cell 에 1ml씩 넣어주었다. 파라필름(parafilm)으로 culture plate를 잘 밀봉한 뒤 dry incubator에서 37도 조건으로 하룻밤 배양하였다. 다음날 형광 현미경으로 cell을 관찰하고 파란색이 얼마나 관찰되는지 확인하였다.Ⅲ. ResultsPicture 3. proliferating cell Picture 4. proliferating cell 확대*cell line : WI38(human lung fibroblast)Picture 3.은 정상적인 세포로, 전반적으로 투명한 색의 세포들이 관찰되었다. Picture 4.은 Picture 3.을 컴퓨터로 확대하여 캡쳐한 사진으로, 자세히 보면 푸른빛이 도는 것 같기는 하다.Picture 5. senescent cell Picture 6. senescent cell 확대Picture 5.은 노화 세포로, 비정형의 들쭉날쭉하고 정상적인 세포보다 커진 모습을 관찰할 수 있었다. Picture 6.은 Picture 5.를 확대한 사진으로, 뚜렷히 보이는 파란색을 관찰할 수 있다.Ⅳ. Discussion200 μm(1) 결과 해석본 실험은 정상적인 세포와 노화 세포에 각각 X-gal이라는 기질을 인위적으로 넣어주는 실험으로서, SA-β-galactosidase 의 존재 여부에 따라 달라지는 결과를 관찰하는 실험이다. 결과적으로, 노화 세포에 SA-β-gal 효소가 존재하므로, 기질을 가수분해 하여 푸른색 빛을 띠는 것을 확인할 수 있었다. 이로써 세포가 노화할수록 SA-β-galactosidase 효소가 특이적으로 발생하는 것을 알 수 있었다.(2) MSC(Mesenchymal stem cells, 인간 중간엽 줄기 세포) 에서의 SA-β-galactosidase 실험 결과성인 또는 신생아 조직에서 유래한 MSC에 스트레스를 유발하여 세포사멸의 증가 및 조기 노화를 유발할 수 있다[7]. 이러한 활성 산소종(ROS)의 축적은 일반적인 세포 노화의 원인이 될 수 있다. 혈청 결핍 또한 MSC의 조기 노화를 촉진할 수 있다. Picture 7.은 낮은(2%) 혈청 농도하에 MSC에서의 SA-β-galactosidase을 보이는데, 노화 세포의 핵이 청색으로 염색되고 세포의 크기가 증가함을 확인할 수 있다[8].Picture 7. 2%의 혈청 농도 하에서 관찰된 MSC 세포의 노화 지표세포가 조기 노화되어 청색을 띄고 세포가 커진 것을 확인할 수 있다[8].이처럼 세포 노화에는 활성 산소종(ROS)나 혈청농도 등 세포마다 다양한 환경에 영향을 받는다. 그 외에도 방사선, 종양성 유전자(Oncogene)등의 요인이 존재한다.(3) SenolyticsSenescent cell은 노화와 함께 축적되고, 암, 2형 당노병, 심장 질환 등 다중 만성 질환에 영향을 미치므로, Senolytic 약물을 개발이 필요하다고 사료된다.Senolytics란 ‘senescence’+ ‘lytic’의 합성어이다. 이는 노화 세포의 죽음을 선택적으로 유도하고 인간에 있는 건강을 개량할 수 있는지 결정하기 위한 연구 분야의 종류 중 하나로, senescent cell을 선택적으로 제거하는 방법을 연구한다[9]. secescent cell을 제거하면 aging process를 제거할 수 있을 것이다.Senolytics 의 한가지 예로 P16 단백질은 노화 세포에 특이적인 마커로서, SA-β-galactosidase와 마찬가지로 노화세포에서 증가되어 있으며 cell cycle arrest를 일으키는 물질이다. Senolytics에 대한 연구는 P16을 발현하는 세포가 있는 형질전환 마우스에서 처음 개발되었는데, 이러한 마우스에서 P16를 절제하면 노화 관련 질병이 억제되는 것을 확인할 수 있었다[10]. 폐 기능 개선, 혈관 반응성 회복, 평균 수명 연장, 골절염 완화, 지방간 질환 개선 등 다양한 노이다.

자연과학| 2024.04.03| 9페이지| 3,500원| 조회(267)

유발, senescence, SA-B-gal, 노화세포

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