Serial dilution and DNA quantification1.Date: 2022.10.282. Object: 올바른 패팻 사용법을 익히고 패팻을 이용하여 용액을 희석한다. 흡광도에 대한 이해를 바탕으로 UV 측정기를 이용하여 DNA를 정량한다.3. Principle1) 파이펫(pipette)파이펫(pipette)이란 일정한 부피의 액체를 옮기는 데 사용하는 실험기구를 말한다. 파이펫의 종류에는 홀 파이펫, 세롤로지컬 파이펫, 마이크로 파이펫이 있다. 마이크로파이펫은 마이크로리터 단위의 액체를 정확하게 흡입하고 분출하며 분자세포생물학 실험에서 가장 자주 사용되는 파이펫이다.*파이펫 사용시 주의 사항팁 끝이 오염되지 않게 주의해야 하며, push botton은 천천히 눌러줘야 한다. 빠르게 누르면 안에 버블이 생겨 결과 오차가 발생할 수도 있으며 파이펫 안으로 시료가 들어가 오염이 될 수 있다. 팁 안에 용액 있으면 파이펫 안으로 시료가 들어가 부식될 위험이 있기 때문에 파이펫을 눕히거나 기울이지 않아야 한다. 내부 클리닝 및 멸균 필요하다. cleaning에는 External cleaining과 internal cleaning이 있으며, 부품까지 분해하여 1년에 한번 calibration할 때 같이 해야 한다. Autoclave은 고온 증기 멸균을 하는 것이며 안되는 기종도 있으니 확인을 해야한다.2) 흡광도(Absorbance or Optical Density(OD))흡광도 혹은 광학밀도(optical density, O.D.)는 어떤 물질(시료)에 빛을 쪼였을 때 투과율의 음의 상용로그값으로 정의된다. 투과율(T, transmittance)은 (투과된 빛의 양, I)/(입사된 빛의 양, I0)로 정의된다. 흡광도는 용액의 농도에 선형적으로 비례하므로, 보통 단색광을 쪼여 용액의 농도를 측정할 때 이를 활용한다.(1) 램버트-비어의 법칙(Lambert-Beer’s law): 용액의 농도(c)가 높을수록, 빛이 통과하는 용액의 거리(d)가 길어질수록 빛을 많이 흡수하게 된다는 법칙이다.4. Reagents and Apparatus1) Reagents : pCS2-myc-kit2a DNA, 염색 용액, 증류수2) Apparatus : Micro tube, micropipette, NanoDrop형 spectrophotometer, 바이오텍 gen5 program, microtube rack5. Procedure1) 필요한 Volume에 맞는 마이크로 파이펫을 선택한다. 본 실험에서는 100-1000 마이크로, 20-200 마이크로, 2-20 마이크로의 단위의 세 종류의 마이크로 파이펫을 사용하였다.3) 파이펫의 끝(Tip holder)에 멸균된 파이펫 팁을 꽂는다.4) first stop에서 걸리는 부분까지 파이펫의 Push Button을 천천히 누르고, 누른 상태로 채취할 시료 용액에 파이펫 팁을 담근 뒤, Push Button을 천천히 원위치로 올린다.5) 용액을 옮길 용기에 파이펫을 살짝 기울여 first stop 까지 파이펫의 Push Button을 눌러 용액을 분배한다.6) 팁에 남아있는 용액을 second stop까지 Push Button을 눌러 남아있는 시료를 빼낸 후 파이펫의 Tip ejector button을 눌러 파이펫 팁을 분리한다. 위의 과정을 반복하여 정해진 용량으로 희석을 진행한다.7) 파이펫 사용법을 익힌 후 736.8ng/μl의 DNA(pCS2-myc-kit2a)를 정해진 농도로 희석을 진행하였다. 다음 식을 사용하여 필요한 DNA의 부피를 구하였다.농도(ng/μl) x 부피(μl)=질량25ng/μl의 농도를 만들기 위해 필요한 DNA의 부피는 0.034μl이었으나 매우 작은 부피이므로 이 값에 100배를 곱한 값인 3.4μl을 사용하였고, 증류수(DW) 96.6μl 을 용기에 파이펫을 이용하여 첨가하였다.50ng/μl 희석액을 만들기 위해 필요한 DNA의 부피는 0.067μl이었으나 위와 같은 이유로 100을 곱한 양인 6.7μl의 DNA를 취하고, 93.3μl의 증류수(DW)를 파이펫을 이용하여 첨가하였다. 200ng/μl의 희석액을 만들기 위해서 필요한 DNA의 부피는 0.27μl로 계산되었으나 이도 매우 작은 부피이므로 10을 곱한 값인 2.7μl을 첨가하였고, 증류수(DW) 7.3μl를 첨가하였다.8) 완성한 희석액의 농도를 확인하기 위해 UV-vis 분광 광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다.9) 먼저 DW를 시료부의 각 칸에 넣어주고 결과를 확인하여 UV-vis가 정상적으로 작동을 하는지 확인하였다.10) 그 뒤에 E2, F2, F3 칸에 시료를 25ng/μl, 200ng/μl, 50ng/μl의 순서로 파이펫을 이용하여 2μl만큼 첨가하였다. 이때에 유리판에 파이펫의 끝이 닿지 않도록 파이펫의 끝을 한 손가락으로 고정한 뒤 조심히 첨가하였다.11) UV-vis 분광 광도계의 흡광도 측정 결과와 목표한 희석 농도와의 일치여부를 확인하였다.6.Results1) DNA 정량에 앞서 파이펫의 사용법을 익히는 과정에서 파이펫의 종류와 사용법에 대하여 자세히 알게 되었다. 특히 파이펫의 button을 끝까지 누르는 것만 알고 있었는데, 파이펫의 button을 누르는 지점에는 first stop과 second stop 두 지점이 있다는 것을 알게 되었다. 또한 파이펫을 이용하여 시료를 첨가할 때 바닥에 파이펫의 끝이 닿지 않도록 조심해야 하며, 이를 위해서 파이펫을 든 쪽의 팔꿈치는 탁자에 두어 고정하고, 다른 손을 파이펫의 끝에 살짝 가져다 데어서 고정을 해주어야 한다는 점도 익혔다.2) UV-vis 분광 광도계를 이용하여 측정한 우리 조의 흡광도는 다음 사진의 E2, F2, F3 값과 같다. E2는 2525ng/μl, F2는 20025ng/μl, F3은 5025ng/μl이 되도록 DNA를 정량하는 것이 목표였으나 E2에서는 약-85.2%, F2에서는 약 15.4%, F3에서는 약-3.1%의 오차가 발생하였다.7. Discussion1) DNA 농도의 오차 발생 원인: 흡광도 측정 결과 중 E2, F2에서 측정한 DNA의 농도의 오차가 크게 발생한 것은 다양한 원인이 복합적으로 작용한 결과라고 추정된다. 그러나 오차를 만들어낸 가장 큰 원인은 DNA와 DW를 각각 마이크로 파이펫을 이용하여 용기에 담은 후에 두 물질이 충분히 섞이지 않아 농도가 균일하지 않았기 때문인 것으로 예상된다. 또한, 오차가 특히 크게 발생한 E2의 경우, DNA를 마이크로 파이펫으로 채취하는 과정에서 목표한 시료의 채취 양이 매우 소량이기 때문에 마이크로 파이펫을 second stop까지 눌러주어 시료를 분주하는 과정에서 DNA가 제대로 분주되지 않았거나 하는 등의 이유로 목표한 양보다 적게 채취하였을 것으로 생각된다.2) UV-Vis 분광광도계: UV-Vis 분광광도계는 시료가 자외선 및 가시광선 영역의 에너지를 흡수하는 정도를 이용하여 정성 및 정량하는 기기이다. 자외선 및 가시광선의 에너지 흡수는 분자내 원자의 전자 전이를 일으키게 되며, 분자내의 전자 구조에 따라 흡수되는 빛 에너지 크기 및 세기가 다르게 나다나므로 전자 구저걱 성질을 알아낼 수 있다. 또한 유기/무기 화합물의 정량 및 특성 분석뿐만 아니라, 시간에 따른 변화량 측정(활성화) 파장에 따른 흡광도 변화를 측정할 수 있다.8. Reference수업 자료_[DNA 정량][네이버 지식백과] 흡광도 [absorbance] (미생물학백과 ) HYPERLINK "https://post.naver.com/viewer/postView.nhn?volumeNo=17365719&memberNo=39141473&vType=VERTICAL" https://post.naver.com/viewer/postView.nhn?volumeNo=17365719&memberNo=39141473&vType=VERTICAL[네이버 지식백과] 흡광도 [absorbance] (미생물학백과 )[출처] 산란 매질의 절대 흡수 분광법 - 독일 Gigahertz Optik 社 SphereSpectro 150H|작성자 wwsoptic아주대학교 공동기기센터 HYPERLINK "https://cmcm.ajou.ac.kr/1023/view/62" https://cmcm.ajou.ac.kr/1023/view/62
Chap 3. Amino Acids, Peptides, and Proteins3.1 Amino Acids[Principle 1] In every living organism, proteins are constructed from a common set of 20 amino acids.모든 생명체에서 ‘단백질을 구성’하는 아미노산 = 20종류->mRNA에서 단백질 합성 시 사용되는 아미노산임.Cf) 이외에도 세포 내에는 300가지 정도의 아미노산이 존재함.-각각의 아미노산은 곁사슬을 가지며 이로 인해 각각의 구별되는 화학적 특성을 가진다. 비유하자면, 아미노산은 단백질 구조라는 언어에서 알파벳의 역할을 한다고 할 수 있다.Amino acids share common structural features-alpha carbon and four substiruents-alpha carbon is the chiral center-tetrahedral 정사면체 구조Amino acid substituents1) a carboxyl group2) an amino group3) a hydrogen atom4) an R group(a side chain unique to each amino acid)(아미노산의 alpha carbon 주위의 bonding orbital은 정사면체의 서열을 하고 있기 때문에 각각 서로 다른 4개의 치환기는 공간 중에서 서로 다른 2가지 배치를 취할 수 있고, 아미노산은 2개의 stereoisomer을 갖게 된다. 이떄 이 2가지의 형은 서로 겹쳐질 수 없는 거울상 관계에 있는enantiomer(거울상이성질체)이다. )-glycine has a second hydrogen atom instead of an R group글라이신을 제외한 모든 표준 아미노산들은 모두 알파-탄소원자에 4개의 다른 치환기가 결합되어 있다. 따라서 alpha carbon은 chiral center이다.R기의 탄소들은 alpha carbon 다음의 탄소부터 beta, gam)는 weak acids/bases로 작용 가능2) zwitterion(양쪽성이온): 이온화할 수 있는 R기가 없는 아미노산이 neutral pH의 물에 용해되면 양쪽성이온으로 존재하고, 산 또는 염기로 작용 가능하다.*수용액 상에서는 아미노산은 양쪽성 이온으로 존재.-NH2: 수소를 잘 받아들이는 성질(염기성)->NH3+가 됨-COOH: proton(수소)를 잘 잃는 성질(산성)->COO-가 됨*양쪽성 이온의 경우 상황에 따라 산/염기로 작용 가능->즉, 양쪽성 물질이므로 buffer의 기능을 가짐1) 산으로 작용하는 경우 수소를 내놓음:NH3+->NH22) 염기로 작용하는 경우 proton을 가지고 옴->COO-에 수소가 결합Titration of amino acids(아미노산의 적정곡선)1) 산-염기 적정: 단계적으로 양성자를 첨가하거나 제거하는 것2) 아미노산에는 아미노기와 카복실기가 존재하고 이 2개의 작용기에서 각각 수소를 주고받을 수 있음Isoelectric point(등전점, pI): the pH at which the net electric charge is 0 (NH3+와 COO-가 동시에 존재하여 서로 전하가 상쇄되어 net charge = 0)Ex. 글라이신을 NaOH로 적정[곡선의 뚜렷한 2가지 단계](1) 적정 1단계: 글라이신의 -COOH가 proton을 잃음-1번 구조와 2번 구조가 정확히 반반되는 지점->COOH에서 proton 내보내는 과정이어서 낮은 pKa를 가짐: acidic pKa(pK1)(2) 적정 2단계: 글라이신의 -NH3+기에서 proton을 제거-2번 구조와 3번 구조가 정확히 반반되는 지점->아미노기의 proton이 제거되는 과정이라 상당히 높은 pKa를 가짐: basic pKa(pK2)Effect of the chemical environment on pKaα-carboxyl group is more acidic than in carboxylic accidsEx. 글라이신의 카복실기는 아세트산의 카복실기보다 1의 크기는 다양length of naturally occurring peptides = 두 개-수천 개의 amino acid residuesPeptide subunitsmultisubunit protein = 2+ polypeptides associated noncovalently2개 이상의 폴리펩타이드가 noncovalent interaction을 통해 뭉쳐져서 단백질을 형성oligomeric protein = at least 2 identical subunits– identical units = protomersoligomeric ptn 또한 multisubunit ptn이긴 하나 동일한 unit이 여러 개 뭉쳐서 기능을 하는 단백질Estimating the Number of Amino Acid Residuesnumber of residues = molecular weight/110(amino acid residue의 평균적인 분자량이 110)average molecular weight of amino acid = ~128molecule of water removed to form peptide bond = 18아미노산의 평균 분자량에서 빠져나간 물의 분자량을 뺴서 구한 값 = 110: 하나의 aa residue의 molecular weightSome Proteins Contain Chemical Groups Other Than Amino Acidsconjugated proteins=아미노산 외의 몇 가지의 화학 성분을 더 가지고 있는 단백질-prosthetic group=아미노산이 아닌 부분lipoproteins(지질 단백질) contain lipids(지질)glycoproteins(당단백질) contain sugars(당질)metalloproteins(금속단백질) contain specific metals(금속)3.3 Working with Proteins[Principle 3] cell, 여러가지 치료에서 이용하기 위해 수천가지 종류의 단백질이 있는데uffer를 흘려주면 ligand와 결합해있던 ptn이 buffer solution에 있던 ligand와 결합해 기존의 ligand에서 떨어져 나가 흘러나감방법② 고농도의 salt를 이용해 electric charge를 이용하는 ptn-ligand 사이의 결합을 방해해 단백질 용출을 유도한다-사이즈, charge를 이용할 경우 비슷한 값을 가진 단백질들이 존재하기 때문에 특정한 단백질만을 분리해내기 어렵다. affinity 크로마토그래피는 특정 단백질만 리간드에 잘 결합하기 때문에 원하는 단백질만 분리해내기 쉽다.ex) 항체의약품-전체적인 항체를 단백질들 중에서 분리할 수 있다. 항체는 각각에 결합하는 안티젠이 있는데, 안티젠을 resin에 결합시켜 리간드로 사용하면 그 안티젠에만 binding하는 항체를 분리해낼 수 있다.*ligand: 이온 또는 분자로, 한 쌍의 전자를 중심 금속 원자 또는 이온에 제공하여 배위 복합체를 형성함.*antigen(항원): 면역 반응을 일으켜 특히 항체를 생산하게끔 만드는 물질로써 일반적으로 생명체내에서 이물질로 간주되는 물질의 총체이다.2. HPLC(High-performance liquid chromatography)고압 펌프를 이용해 ptn을 column 아래로 이동시킴resolution(해상도)를 크게 향상시킴-빠른 속도/적은 시간/limited diffusion(확산 덜 일어남)->HPLC를 이용하면 ptn이 칼럼을 통과하는 속도가 빨라져 칼럼에 머무는 시간이 짧아지고, diffusion이 덜일어나 sharp하게 분리 가능(diffusion의 정도는 ptn이 column에 머무는 시간에 비례)Sequential Purification Steps Decrease Sample Sizeactivity: the total units of enzyme in a solution-용액에 있는 엔자임의 총 단위specific activity: number of enzyme units per milligram of total ptn- 구조는 특정한 기능을 지정함대부분의 human ptn은 polymorphic하다-똑같은 ptn이어도 사람마다 아미노산 서열이 다른 variant가 있음-한 사람에서도 비슷한 기능을 갖는 ptn들이 있는데 구조를 비슷하지만 sq가 조금씩 다른 경우가 잇다아미노산 서열을 알아내는 방법: Edman degradation. Sanger sequencingProtein structure is studied using methods that exploit protein chemistrytraditional ptn sequencing techniques:labeling ptns(단백질의 위치를 표지)breaking ptns into parts-단백질이 너무 길면 분석이 힘듦->적절한 위치에서 ptn을 잘라 peptide 조각으로 만드는 것이 필요[Studying protein structure]1) Labeling표지해주는 시약: FDNB, dansyl chloride, dabsyl chloride 등이 있음->label amino-terminal(N-terminal) α-amino groupand ε-amino group of lysine residuesFDNB: 아민기에 반응한다. N-termaus에 FDNB가 결합하기 때문에 적어도 N 말단에 있는 ptn이 무엇인지를 알 수 있다ex. Lysine의 경우 아미노기를 포함한 residue가 있어 거기에도 반응한다2) Breaking bonds(단백질을 잘게 쪼개는 방법)폴리펩타이드 내 또는 폴리펩타이드 subunit 사이의 disulfide bond는 비가역적으로 끊어질 수 있다1) oxidation: performic acid 사용->S 주위로 O가 결합해 끊어짐2) reduction: DTT(dithiothreitol=reducing agent. 다른 것을 환원시킨다) 사용->수소를 결합시켜 환원시켜서 끊어낸다3) Using proteases*하나의 펩타이드에 있는 여러 aa 결합을 끊어주는 방법1) 가수분해: bts
CH 1. The Foundations of Biochemistry[Principle 1] Cells are the fundamental unit of life.-세포는 생명의 기본 단위. 세포들은 복잡성 다양하고 multicellular organism(다세포 생물) 내에서 환경이나 기능에 매우 특화될 수 있지만, 기본적으로 서로 많은 유사점을 공유한다.[Principle 2] Cells use a relatively small set of carbon-based metabolites to create polymeric machines, supramolecular structures, and information repositories.-polymeric machine: 주로 단백질. 아미노산을 기본체로 하여 aa가 모여서 이루어짐.-supramolecular complex: cell membrane이 대표적. 지질이 모여서 이루어짐.-information repository: 유전정보를 저장. DNA, RNA 등. 역시 탄소로 이루어진 nucleotide가 모여 이루어짐[Principle 3] Living organisms exist in a dynamic steady state, never at equilibrium with their surroundings.-생명체는 역학적으로 정상 상태에 존재하지만 주위와 절대로 평형 상태를 이루지는 않는다. 열역학의 법칙에 따라 생명체는 주위로부터 에너지를 추출하여 항상성을 유지하고 유용한 일을 하게 한다.[Principle 4] Cells have the capacity for precise self-replication and self-assembly using chemical information stored in genome.-세포는 유전체 안에 저장된 화학 정보를 사용하여 자기복제(self-replication)와 자기조립(self-assembly) 능력을 갖는다.-1개의 세균 세포는 24시간 안에 10억 id of[-이 전혀 없는] O2; organisms transfer electrons to nitrate, sulfate of CO2 for energy.(1) obligate anaerobes = die when exposed to O2(산소 있으면 죽음)(2) facultative anaerobes = can live with or without O2(산소 없어도 살 수 있는데, 있어도 괜찮음)Organisms differ widely in their sources of energy and biosynthetic precursors[생물체들은 에너지와 생합성의 전구체들을 다양한 원천에서 다르게 얻는다]1) phototrophs[광영양생물] = trap and use sunlight2) chemotrophs[화학영양생물] = derive energy from oxidation of a chemical fuel 화학적 연료를 산화시켜 에너지 이용3) autotrophs[독립영양생물] = can synthesize all their biomolecules directly from CO24) heterotrophs[종속영양생물] = require some preformed organic nutrients mde by other organismsClassifying organisms according to their source of energyBacteria and archaeal cells share common features but differ in important ways세균과 고세균은 모두 단세포생물로 유사성이 있다>진핵생물과 달리 세포막 외에 외피(cell envelope)가 있다-cell envelope[세포외피] = composed of plasma membrane, outer membrane, and peptidoglycan(high molecular weight polymer)Bacterial and archaeal cell envelopes, ionic interactions, van der waals interactions, hydropohbic effect)*단량체들이 화학적으로 결합해서 고분자 형성. 고분자들이 밀집된 형태가 supramolecular. 이떄, 공유결합을 한 것이 아니다!1.2 Chemical Foundations 화학적 기반Biomolecules are compounds of carbon with a variety of functional groups-가장 중요한 것은 탄소. 탄수화물/단백질/지방 모두 탄소가 중심이 되어 구성된다.-탄소는 단일 결합/이중 결합/ 삼중 결합이 가능하고 사중 결합은 안정적이지 않기 때문에 거의 없다고 봐도 된다Geometry of carbon bonding탄소 원자가 4개의 단일 결합을 이룰 경우 사면체 형태(tetrahedral arrangment) 형성free rotation around each single bondlimited rotation about the axis of a double bond-이중 결합에서는 자유롭게 rotation이 일어날 수 없고, 최대한 멀리 떨어져 있기 위해 120도로 떨어져 있다.Cells contain a universal set of small molecules1) central metabolites: 종에 관계 없이 공통적으로 있는 것들-common amino acids-nucleotides-sugars and their phohphorylated derivatives[인산화 유도체]-mono-/di-/tri- carboxylic acids2) secondary metabolites: 종에 따라 있는 것이 다른 metabolites-metabolome = entire collection of small molecules in a given cell under a specific set of conditions-metabolomics = metabolome에 대해 다루는 학문.Macromoleculeo optical rotation2) diastereomers = 서로 거울상이 아닌 stereoisomersMolecular conformation-conformation = 치환기 groups의 공간적 배열다 같은 molecules인데 단일 결합이 각각 상황에 따라 rotation되는 정도/상태가 다른 것.Conformation에 따라 분자가 가지는 에너지가 변화fully eclipsed conformation: rotation했을 때 서로 functional groups가 겹치면 방해를 받을 수 있으며(불안정) 이때 높은 에너지를 갖게 됨.fully staggered conformation: 서로 잘 떨어져 있는 상태로 에너지가 낮은 상태.Interactions between biomolecules are stereospecific-Conformation/configuration이 중요한 이유:생체 내 반응은 대부분 단백질과 반응하는 것인데, 단백질과의 interaction이 configuration/conformation의 영향을 받기 때문(단백질끼리 작용할 때 이런 구조를 다 인식해서 작용함.Biologycal systems can distinguish stereoisomers-stereospecificity = 입체 이성질체를 구분할 수 있는 특성들(a) Aspartame = chiral center가 있음-L-form은 단맛/D-form은 쓴맛->완전히 다른 성질 가짐(b) 항우울제로 사용되는 Citalopram-S-form은 활성 있음/R-form은 완전히 활성 없음Physical Foundations 물리적 기반Living organisms exist in a dynamic steady state, never at equilibrium with their surroundings-생물은 가만히 있는 것처럼 보이지만 사실은 세포 내/외부에서 물질과 에너지를 교환하는 동적 평형을 이룬다Organisms transform energy and matteg organsims에 있다.Metabolism is regulated to achieve balance and economy-feedback inhibition = keeps the production and utilization[활용] of each metabolic intermediate[대사 중간산물] in balance->음성피드백: 아이소류신의 양이 많으면 첫번째 단계에 작용하는 enzyme을 inhibition해 pathway를 조절-systems biology[시스템 생물학]: 실제 생명체에서 일어나는 과정은 매우 복잡. 다른 피드백 루프가 있을 수도 있는 등..complex하게 연결되어있기 때문에 이런 것들에 대해 한번에 접근하려 하는 학문Genetic Foundations 유전적 기반Genetic information>deoxyribonucleic acid,DNA = 유전정보 많이 저장되어 있다Genetic continuity is vested in single DNA molecules-DNA of an E.coli cell = 460만 개의 nt pair로 이루어짐-세포 분열 시 자손(progeny)에게 거의 완벽하게/동일하게 복제됨.The structure of DNA allows its replication and repair with near-perfect fidelity[정확도]아주 완벽라지는 않고, 조금의 오류가 있다->진화가 가능한 이유-deoxyribonucleotides = DNA 중합체 형성하는 monomeric subunit-각각의 디옥시리보뉴클레오타이드는 상보적으로 반대 가닥에 있는 디옥시리보뉴클레오타이드와 쌍을 이룸-가닥들은 hydrogen bonds에 의해 서로 연결되어 있다The linear sequence in DNA encodes proteins with Three-dimensional structures-native conformation[고유 입체형태] = 단백질의 3차 구조는 단백질의 기능에 매우 중요*DN이다
파이펫 사용법(serial dilution and DNA quantification) 실험 레포트
