진핵생물의 DNA 분리

소개

Homologous recombination으로 생성한 p53 knockout mouse의 gDNA를 분리해보고 진핵 생물 DNA 분리 방법과 원리를 이해한다. 또한 genotype 분석 방법 중 하나인 PCR을 통한 genotyping으로 DNA 분리 결과를 확인하고 그 방법과 원리를 이해한다.

목차

1.Abstract
2.Introduction
3.Method
4.Result
5.Discussion
6.Reference

본문내용

Ⅰ. Abstract
이번 실험에서는 Homologous recombination으로 생성한 p53 knockout mouse의 gDNA를 분리해보고 진핵 생물 DNA 분리 방법과 원리를 이해한다. 또한 genotype 분석 방법 중 하나인 PCR을 통한 genotyping으로 DNA 분리 결과를 확인하고 그 방법과 원리를 이해한다.
실험에 필요한 p53 gene의 기능의 inactivation된 knockout mouse를 생성하기 위해서 이번 경우에는 gene targeting의 방법을 이용한다. 이 방법은 특정 gene과 동일하거나 비슷한 sequence를 공유한 artificial DNA 조각을 사용하는데 여기서는 tag으로 neomycin을 사용하며, 세포 내 nuclear machinery가 이 둘의 homologous sequence를 동일한 것으로 인지하여 gene의 일부와 artificial DNA 조각의 일부를 뒤바꾸어 recombinant를 형성하게 된다. 이 방법으로 얻어진 embryo의 자손으로부터 p53 knockout mouse를 획득할 수 있다. 그 후 genomic DNA를 분리하기 위해 lysis한 후 isopropanol을 이용해 침전시키고 washing하여 gDNA sample을 얻어낸다. 이렇게 획득한 genomic DNA는 Southern blot이나 PCR을 통해 그 genotype을 분석할 수 있는데, 이 실험에서는 PCR을 이용한다. Wild type에 비해 p53 mutant는 Exon5와 Exon6 자리가 Neomycin으로 치환되어 있기 때문에 각각의 primer를 넣어주면 그 size에 따라 band가 나타난다. Wild type은 400bp에서 p53-/-는 700bp에서 band가 나타나므로 homo-와 hetero-의 여부를 확인할 수 있다.
분리한 genomic DNA를 gel에 걸어 loading한 사진을 보면 gDNA의 size는 10kb보다 크다는 사실을 확인할 수 있다

참고자료

· - Watson 외, Molecular biology of the gene, 5th edition, 2004, Pearson, pp.648-662