cloning

소개

PCR 다음실험

-DNA에서 제한효소를 이용하여 원하는 제한부위를 자른다.
-ligase를 이용하여 DNA를 절편을 vector안에 삽입한다.

목차

1.Introduction
2.Materials and methods
3.Results and Discussion
4. Questions

본문내용

1.Intuction
SYT11 DNA를 pGEX-4T vector의 multi-cloning site에 넣을 것이다. 이것을 하기 위해서 SYT11 DNA의 제한 구역(Restriction sites)과 vector는 제한효소(BamH I/EcoR I)로 끊어줘야 한다. 그 후에 STY11 DNA는 BamH I, EcoR I, oligos등을 제거하여 정제한다. 두 개의 DNA 분자가 섞이자 마자 T4 DNA Ligase로 처리함으로써STY11 DNA는 공유결합으로 pGEX-4T vector에 삽입된다.
Goal
-DNA에서 제한효소를 이용하여 원하는 제한부위를 자른다.
-ligase를 이용하여 DNA를 절편을 vector안에 삽입한다.
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4.Questions
1. 다음 작용을 하는 효소의 특성을 기술하라
1) the Digestion of Restriction sites in SYT11 DNA
- 제한효소(restriction enzyme)으로 특정염기서열을 인식하여 절단한다. 이번 실험에서는 BamH I과 EcoR I를 사용하였다. BamH I은 DNA 염기서열중 GGATCC인 곳을 인식하여 G^GATCC 부분을 절단하고 EcoR I은 DNA 염기서열중 GAATTC인 곳을 인식하여 G^AATTC 부분을 절단한다.
2) the Ligation of SYT11 DNA into the vector
- T4 DNA ligase는 DNA 단편을 연결하는데 사용된다. DNA 잘린 단편의 sticky ends은 대게 4개의 base pair정도 떨어져있는 곳에서 nicks를 갖는다. Nicks는 phosphodiester backbond이 깨져있지만 모든 nucleotide는 존재한다. T4 DNA ligase는 nick의 3‘hydroxyl end와 5` phosphate end와 결합시키기 위해 ATP를 사용한다.

2. STY11 DNA를 정제하기 위해서 DNA를 high salt buffer가 있는 Silica column에 넣는다. 그리고 low salt buffer에서 elute한다. DNA가 Silica 대해 설명하라.
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참고자료

· 없음