[생화학]Protein Concentration Determination

소개

I. Introduction

1. 단백질 정량분석
단백질 검출을 통한 단백질의 정량 분석하는 방법에는 대표적으로 뷰렛반응(칼슘이온이 펩타이드와 결합하여 색이 변하는 원리를 이용, 감도 1-10mg), 로우리법(Lowry: 금속성 이온이 고리형구조의 잔기를 가진 아미노산과 결합하는 원리, 감도 20-300 μg), BCA 법(Lowry법을 응용, BCA reagent 사용), 브래드포드법(Bradford: 쿠마시블루라는 염색약과 염기성 아미노산(라이신)의 결합으로 색이 변함, 감도 1-100μg), 그리고 자외선법(고리형 구조의 아미노산이 280nm의 파장을 가지는 빛을 흡수하는 원리를 이용)이 있다.
단백질을 정량분석하기 위해서는 우선 가수분해시켜야 한다. 단백질을 가수분해하면 Peptide Bond가 끊어져 Amino Acid로 나뉘는데, 단백질은 보통 6N HCl용액에 단백질을 넣고 공기를 제거하고 밀봉하여 100C에서 8시간~24시간 동안 가열하여 가수분해시킨다. 이런 가열조건에서는 모든 Peptide Bond가 파괴되며 Amino Acid 중 Glutamine과 Asparagine은 Side Chain의 Amino Bond까지 파괴된다. Tryptophan, Serine, 그리고 Threonine 등의 Amino Acid는 쉽게 파괴될 수 있으므로, 이러한 아미노산을 포함한 단백질의 경우 특별한 주의를 필요로 한다.
Acid Solution에서 파괴된 Amino Acid를 분석하기 위해서는 단백질을 Alkaline Hydrolysis 시켜 분석한 후 보정한다. 즉, 단백질의 양을 정량하기 위해서는 단백질의 본질, 단백질 시료에 포함된 여러 기타 성분, 정량분석의 신속도 및 정밀도 등에 따라 알맞은 Method를 선택해야 한다.

목차

I. Introduction
1. 단백질 정량분석
2. Beer-Lamber law
3. Ninhydrin reaction
4. Biuret reacion
4. Bicinchoninic Acid (BCA) Assay

Ⅱ. Materials and Methods

Ⅲ. Results
1. 흡광도 측정 data
2. 회기분석을 이용한 graph

Ⅳ. Discussion

Ⅴ. Reference

본문내용

BCA assay를 통한 단백질 정량방법은 어떠한 농도에서는 흡광도 값이 얼마이고, 또 다른 농도에서는 흡광도가 얼마라는 것이 측정되어 표준값이 정해지면, 미지의 시료의 경우도 흡광도 값만으로 농도를 구할 수 있고, 농도를 알면 그 샘플의 단백질 양을 알 수 있는 비교적 간단하면서도 쉬운 정량법이라고 생각된다.
실험 결과 BSA는 연한 보라색에 가깝게 발색하였다. 단백질에 의해 환원된 구리 이온은 BCA용액과 반응을 해서, 보라빛의 화합물을 생성하게 된 것이다. 이 화합물은 빛의 특정 영역(562nm)에서 구리 이온이 담긴 용액과 BCA용액 각각보다 빛의 흡수율이 높기에, spectrophotometer를 사용해서 측정하면 흡수율 차이를 측정할 수 있었다. 단백질의 양이 많으면 보다 많은 보라빛 화합물이 생성 되었을 테고, 그 화합물은 빛을 더 많이 흡수하니까 흡광도는 증가하고, 그것에 비례해서 미지의 샘플 농도를 가늠할 수 있었다.
실험결과 발생하는 오차는 다양한 원인이 존재하기 때문에 명확히 지적할 수 없지만, 실험과정의 미숙함에서 발생한 cuvette의 오염, 흡광도 측정에 사용되는 복사선이 기기 자체의 불안정성으로 인해 stray radiation으로 오염되었을 가능성 등을 생각해 볼 수 있겠다. 또한 protein standard sample등 시료를 준비나 BCA-CuSO4 혼합용액 vortexing 작업 시 pipetmam등의 실험도구 조작에 익숙하지 않았던 점등이 오차의 원인으로 생각된다.

이번 실험 레포트는 BCA assay 이외의 단백질 정량실험에 대해서도 공부해 볼 수 있는 좋은 기회가 되었다. 그 중 대표적으로 Bradford assay와 Lowry assay가 있는데, 앞에 언급하였듯이 BCA assay는 Lowry assay를 수정하여 만든 정량법이라는 등의 사실들을 알 수 있었다. 직접 실험을 통해 이들의 장단점이나 방법들을 비교해보지는 않았지만 레포트를 준비하면서 자료들을 통해서 이론적으로나마 읽고 공부 할 수 있었던 것 같다.

참고자료

· 1. David L. Nelson Micheal M.Cox, 2000, Lehinger Principles of Biochemistry, third edition, worth publishers, New York, 121p.
· 2. David Harvey, 2001, 현대분석화학, McGraw-Hill, Korea 368~393p.
· 3. http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chem-ed/spec/beerslaw.htm
· 4. http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/bca.html
· 5. http://www.piercenet.com/Objects/view.cfm?type=Page&ID=7E56D1E7-5BC9-478A-8272-C0B846DB43E7
· 6. http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chem-ed/spec/beerslaw.htm
· 7.
· http://myhome.hanshin.ac.kr/stat-kric/%BB%E7%C8%B8%C5%EB%B0%E8%BA%D0%BC%AE/re.htm