현대생물학실험2 3차 풀레 Recombinant plasmid DNA의 restriction enzyme cut/ DNA ligation/ Mini-scale preparation of plasmid DNA&Double cut&gel electrophoresis (A0)

소개

"현대생물학실험2 3차 풀레 Recombinant plasmid DNA의 restriction enzyme cut/ DNA ligation/ Mini-scale preparation of plasmid DNA&Double cut&gel electrophoresis (A0)"에 대한 내용입니다.

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Meterial & Method
4. Results
5. Discussion
6. Reference

본문내용

1. Abstract
본 실험은 manual prep 한 plasmid DNA를 NdeⅠ와 HindⅢ로 절단하고 전기영동 결과를 확인한 후, ligation과 mini-prep(kit)를 거쳐 결과를 확인하는 것에 목적이 있다. 제한효소는 DNA의 특정 염기서열을 인식해 절단하는 효소로 본 실험에서는 정밀성이 높은 TypeⅡ의 NdeⅠ와 HindⅢ를 사용하여 pET-21a(+) vector와 insert의 double digestion을 진행하였다. 이 과정을 통해 vector의 양 끝이 self-ligation 되는 것을 방지할 수 있으며, 이외에도 vector의 5’-end dephosphorylation 방법이 사용가능하다. 제한효소 사용 시 적절한 buffer로 star activity를 방지하고 효율을 높일 수 있다. buffer는 Tris-HCl, 〖MgCl〗_2, NaCl, DTT로 구성되며 둘 이상의 효소 사용 시 범용 buffer를 이용한다. 절단 후 전기영동한 결과 vector uncut은 5000~6000 bp의 band가, prep DNA는 3500 bp와 4500 bp. 750 bp의 세 band가, vector cut은 6000 bp의 band가 확인되었다. prep DNA의 750 bp band는 insert DNA이고, 3500 bp와 4500 bp의 band는 vector의 topological state 차이로 인해 형성된 것이라 예상하였다. 이후 T4 DNA ligase를 이용해 vector와 insert를 연결하고 competent cell에 형질전환한 후 plasmid DNA와 vector sample을 LB-Amp agar plate에서 배양하였다. 이는 vector의 self-ligation 정도를 확인해 형질전환 효율을 파악하기 위함이며 ligation sample에서 더 많은 수의 colony가 나왔다. insert와 vector는 3:1 molar ratio로 구성하였다. 이후 ligation colony 중 하나를 배양해 mini-prep(kit)하여 다시 제한효소로 절단 후 전기영동하였다. kit prep은 manual에 비해 순도 높은 DNA를 짧은 시간 안에 얻을 수 있다. 실험 결과 vector-insert ligation uncut sample은 5000 bp~8000 bp의 band가, cut 한 sample은 6000 bp와 750 bp에서 두 개의 band가 확인된다. 750 bp band는 insert DNA로 ligation 된 plasmid를 잘 선택해서 배양했음을 확인할 수 있다. insert가 들어간 plasmid만을 선별하기 위해서는 lacZ selection이나 PCR Screening 방법을 사용할 수 있다.

참고자료

· Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
· New England Biolabs. (2020). Restriction Enzyme Troubleshooting Guide.
· New England Biolabs (2020).Guidelines for Restriction Digestion.
· Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. (2002). Current Protocols in Molecular Biology(Vols. 1–4). John Wiley & Sons.