현대생물학실험2 2차 풀레 Agarose Gel Electrophoresis & Gel Purification/TA Cloning & Transformation/Mini-scale preparation of plasmid DNA(Mini-Prep) (A0)

소개

"현대생물학실험2 2차 풀레 Agarose Gel Electrophoresis & Gel Purification/TA Cloning & Transformation/Mini-scale preparation of plasmid DNA(Mini-Prep) (A0)"에 대한 내용입니다.

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Meterial & Method
4. Results
5. Discussion
6. Reference

본문내용

1. Abstract
본 실험은 PCR product를 전기영동 후 정제해 얻은 DNA를 T vector에 넣어 TA cloning 한 후 ligation을 확인하고 Mini-prep으로 plasmid DNA만 정제하여 확인하는 것에 그 목적이 있다. agarose gel electrophoresis는 크기에 따라 DNA를 분리하는 방법으로 agarose gel의 농도가 높을수록 DNA의 이동 속도가 낮아지고 분해능이 높아지며 pH, DNA 구조, 온도 등이 DNA 이동 속도에 영향을 준다. 크기에 따라 분리한 DNA를 High-salt extraction으로 gel purification 하였는데, 이 과정에서 PCR product에 있던 불순물을 제거하고 target DNA만 분리할 수 있다. PCR product와 gel purification 한 sample 모두 750 bp에서 band가 확인되었다. 임의의 vector에 target gene을 삽입하고 세포에 주입해 증폭하는 기법을 cloning이라 하며 본 실험에서는 정제한 DNA를 T vector에 1:3의 molar ratio로 삽입하여 TA cloning 하였다. T4 DNA ligase를 사용하여 ligation 하였으며, 대신 Taq DNA ligase가 사용될 수 있다. ligation 여부를 LacZ selection을 통해 확인하였으며, 이는 LacZ gene에서 발현되는 β-galactosidase에 의한 X-gal의 분해 여부에 따른 colony 색 변화를 이용하는 방법이며 wt E.coli에서는 사용할 수 없다. 생성된 white colony를 골라 alkaline lysis Mini-prep 방법을 통해 plasmid DNA를 분리하였다. 이는 alkaline 환경에서 plasmid DNA와 genomic DNA의 변성 정도가 다른 것을 이용한 것이며 genomic DNA가 너무 작게 분해되지 않도록 주의해야 한다. 분리된 plasmid DNA를 전기영동한 결과 3800 bp 부근에 band가 나타나야 하지만 아무 band도 관찰되지 않았다. 이는 colony 배양 환경이 적절하지 않아 colony가 작게 형성되었고 Mini-prep 과정에서 lysis와 침전이 제대로 되지 않았기 때문이라 예상한다.

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