현대생물학실험1 2차 풀레 6x His tagged eGFP의 과발현과 정제 및 정제 확인과 정량(A0)

소개

"현대생물학실험1, 6x His tagged eGFP의 과발현과 정제 및 정제 확인과 정량(A0)"에 대한 내용입니다.

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Meterial & Method
4. Results
5. Discussion
6. Reference

본문내용

1. Abstract
본 실험은 eGFP에 6x-Histidine을 tagging 하여 과발현 시키고 affinity chromatography와 ultrafiltration을 사용하여 정제한 후, extinction coefficient assay와 SDS-PAGE, Lowry assay, spectrofluorometer를 진행하여 정제된 eGFP을 정량화하는 것을 목적으로 한다. 실험에서 사용한 eGFP는 kanamycin 저항성 gene을 가진 pET28a(+) plasmid vector를 사용하여 T7 RNA polymerase를 암호화하는 BL21(DE3) 숙주 세포에서 과발현 시켰다. Sonication을 통해 cell disruption을 진행하여 cell protein mixture를 얻고 IMAC를 통해 eGFP를 정제하였다. Ultrafiltration으로 sample에 내재하는 불순물을 제거하고 280 nm, 488 nm에서의 흡광도를 spectrophotometer를 통해 측정한 후 Lambert-Beer’s law를 통해 농도를 구했다. 실험 결과, 280 nm에서는 0.2467 mM, 488 nm에서는 0.1793 mM의 농도가 나와 purity가 72.68 %라는 것을 확인하였으며 두 파장에서의 농도 차이의 원인은 280 nm에서 eGFP가 아닌 다른 물질의 흡광도가 같이 측정되었기 때문이라고 판단하였다. Lowry assay를 통해 BSA 표준 곡선과 750 nm에서 eGFP의 흡광도를 비교하여 농도를 도출한 결과 0.351 mM를 얻었다. Lowry assay에서 측정한 농도가 extinction coefficient assay에서 측정한 농도보다 높은 이유는 Lowry assay가 아미노산의 잔기에 영향을 받기 때문이다. SDS-PAGE 결과, eGFP의 MW인 28.3 kDa에서 선명한 band를 관찰하였다. Spectrofluorometer로 emission, excitation scan을 측정한 결과, eGFP의 알려진 peak와 유사하여 순도 높은 eGFP를 얻었음을 확인하였다.

참고자료

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