서강대학교 현대생물학실험1 Tag DNA Polymerase 발현 및 정제, PCR을 통한 재조합 단백질 확인

소개

2024년 1학기에 수강한 서강대 현대생물학실험1의 첫번째 레포트입니다.

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Materials & Methods
4. Results
5. Discussion
6. References

본문내용

특정 단백질을 발현시키기 위해서는 목적 단백질을 발현하게 해주는 vector를 숙주세포에 넣어 발현시킨다. 숙주세포로는 주로 E.coli(Eschrichia coli)가 많이 이용된다. E.coli는 분열시간이 짧으므로 적은 시간 동안에도 단백질을 많이 얻을 수 있다는 장점 때문이다. 본 실험에서는 pTTQ18 vector를 사용하여 Taq DNA polymerase를 lac operon으로 발현하고자 하였다. 세포 내부로부터 분자를 분출하는 방법인 cell disruption에는 enzymatic method와 detergent method 등의 방법이 있다. Taq DNA polymerase는 Thermus aquaticus로 부터 얻은 것이기에 고온에서 안정하고 활성을 가지므로 고온 조건에서의 incubation을 하면 다른 단백질(고온에서 안정하지 못한 단백질)과 손쉽게 분리해낼 수 있다. Salting out은 시료에 염을 가함으로써 용해도의 변화를 일으켜 단백질이 침전하는 것으로 이 방법을 통해 단백질을 정제하였다. 그리고 이 과정에서 가한 염 제거를 위하여 삼투 작용을 원리를 이용하는 protein dialysis를 진행한다. 본 실험의 목표 단백질인 Taq DNA polymerase의 발현을 확인하기 위해서 PCR을 이용해 DNA의 증폭 여부를 확인하였다. PCR(Polymerase Chain Reaction)이란 DNA의 특정 부분만 증폭하는 기술로, 이중가닥의 DNA를 단일가닥으로 분리하는 denaturation 단계, primer가 template DNA에 결합하는 annealing 단계, template과 상보적인 새 DNA 가닥을 합성하는 elongation 단계로 나눌 수 있다. 전기영동은 분자의 모양이나 크기 등에 따라서 분리를 하는 방법으로 DNA도 분리 가능하다. 실험 결과, 전기영동 후 DNA size marker와 positive control에서는 정상적으로 band가 나타났지만 실험을 통해 발현시킨 Taq DNA polymerase의 샘플에서는 band가 관찰되지 않았다. 그리고 그 이유로 단백질 변성 혹은 희석 정도에 따른 Taq DNA polymerase의 농도 감소로 추론하였다.

참고자료

· Nelson, David L., Cox, Michael M.(2023), 레닌저 생화학, 제8판, 월드사이언스, p. 59
· GEOFFREY M. COOPER(2021), 세포학: 분자적 접근, 제8판, 월드사이언스 p. 127~131
· VanGuilderHD, VranaKE, FreemanWM(2008), Twenty Five Year of Quantiitative PCR for Gene Expression Analysiss, Biotechniques, p. 620~628