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리포트 / 자연과학

A+ 생화학실험 <5주차. Transformation> 레포트

안녕하십니까. 생화학실험 PRE+MAIN 레포트 통합본입니다. 생화학실험 1등으로 A+ 받았습니다. 레포트 외에도 최신 기출을 반영한 <퀴즈&기말고사 대비 정리노트>를 판매 중이니 공부하시는데 도움이 되었으면 좋겠습니다.
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최초등록일 2024.08.14 최종저작일 2024.06
Transformation 서강대 서강대학교 생화학실험
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A+ 생화학실험 &lt;5주차. Transformation&gt; 레포트
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    소개

    안녕하십니까.

    생화학실험 PRE+MAIN 레포트 통합본입니다.
    생화학실험 1등으로 A+ 받았습니다.

    레포트 외에도 최신 기출을 반영한 <퀴즈&기말고사 대비 정리노트>를 판매 중이니 공부하시는데 도움이 되었으면 좋겠습니다.

    목차

    1. Title
    2. Purpose
    3. Theory
    4. Chemicals & Apparatus
    5. Procedure
    6. Data & Result
    7. Discussion
    8. Reference

    본문내용

    1. Title
    5주차. Transformation

    2. Purpose
    E. coli의 transformation을 진행한 후, transformation efficiency 계산을 수행한다.

    3. Theory
    3.1 Competent cell (DH5α)
    일반적으로 박테리아는 외부 DNA를 받아들이는 능력이 매우 제한적이다. 이로 인해 자연 상태에서는 transformation이 매우 비효율적으로 일어난다. 이에 효율적인 실험을 위하여 외부 DNA를 더욱 효과적으로 받아들이도록 유전적 변형이 일어난 cell이 필수적이며, 이러한 cell을 competent cell이라 한다. 실험 시 주로 사용되는 competent cells에는 BL21과 DH5α가 있다.
    BL21은 ompT protease에 돌연변이가 발생하여 단백질 분해 효소의 기능을 상실하게 된다.
    는 단백질 발현 실험에서 특히 중요하게 사용되며, 외부에서 도입된 단백질이 분해되지 않게 한다. 반면, 본 실험에 사용할 DH5α는 recA1 유전자의 160번 아미노산이 glycine에서 aspartic acid로 변이되어 endonuclease의 기능을 상실하고 재조합 효소의 활성을 억제한다. 이는 삽입된 plasmid DNA가 세포 내에서 안정적으로 유지되고 분해되지 않도록 보장한다. 이에 DNA cloning을 비롯한 분자생물학적 기법에서 활용된다.

    3.2 Plasmid DNA
    Plasmid DNA는 박테리아의 chromosomal DNA와 물리적으로 분리되어 있으면서 자체 복제 능력을 가진 extrachromosomal DNA 분자이다.

    참고자료

    · Jerem MB, Biochemistry, Freeman, 2015, 8th ed, pp. 870-880, pp. 925~927.
    · Layla FA, Mohammed LA, Transformation of Saccharomyces cerevisiae by pET plasmid using lithium acetate, World journal of experimental biosciences, 2015, 3(2), pp. 57~60.

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    • 1. Competent cell (DH5α)
      Competent cells, such as DH5α, are a crucial component in molecular biology and genetic engineering. These cells have been genetically modified to be highly receptive to foreign DNA, making them ideal for transformation experiments. DH5α cells are commonly used due to their high transformation efficiency, which allows for the successful incorporation of plasmid DNA into the bacterial cells. The ability of these cells to readily take up and maintain plasmid DNA is essential for various applications, including gene cloning, protein expression, and genetic manipulation. Understanding the properties and handling of competent cells like DH5α is fundamental to many molecular biology techniques and experiments.
    • 2. Plasmid DNA
      Plasmid DNA is a circular, extrachromosomal genetic element that is widely used in molecular biology and genetic engineering. Plasmids are often employed as vectors to introduce foreign DNA into host cells, such as bacteria, for various purposes. They typically contain essential elements like origins of replication, selectable markers (e.g., antibiotic resistance genes), and multiple cloning sites that facilitate the insertion and manipulation of target genes. The ability to isolate, purify, and manipulate plasmid DNA is a core skill in molecular biology, enabling researchers to study gene expression, perform genetic modifications, and produce recombinant proteins. Understanding the properties, structure, and applications of plasmid DNA is crucial for many experimental procedures in the field of biotechnology and genetic research.
    • 3. Ampicillin resistance
      Ampicillin resistance is a commonly used selectable marker in molecular biology and genetic engineering. Many plasmids are engineered to confer ampicillin resistance to the host cells, allowing for the selection and identification of successfully transformed bacteria. This resistance is typically achieved by the inclusion of the β-lactamase gene, which encodes an enzyme that inactivates the ampicillin antibiotic. The presence of this resistance marker enables researchers to selectively grow and propagate only the transformed cells, as the untransformed cells will not survive in the presence of ampicillin. Understanding the mechanism and applications of ampicillin resistance is essential for the successful execution of various cloning, expression, and screening experiments involving plasmid DNA.
    • 4. Transformation
      Transformation is a fundamental technique in molecular biology and genetic engineering, where foreign DNA is introduced into a host cell, such as bacteria, to confer new genetic properties. This process involves the uptake of plasmid DNA by competent cells, which are cells that have been made permeable to allow the entry of exogenous DNA. Successful transformation leads to the integration of the plasmid DNA into the host cell, enabling the expression of the genes carried by the plasmid. Transformation is a crucial step in many applications, including gene cloning, protein expression, and genetic manipulation. Understanding the principles, protocols, and factors affecting transformation efficiency is essential for the successful execution of a wide range of molecular biology experiments.
    • 5. Transformation efficiency
      Transformation efficiency is a crucial parameter in molecular biology and genetic engineering, as it determines the success rate of introducing foreign DNA into host cells. Transformation efficiency is typically measured as the number of colony-forming units (CFUs) per microgram of plasmid DNA used in the transformation process. A high transformation efficiency is desirable, as it increases the likelihood of obtaining the desired transformants and facilitates the subsequent steps in genetic manipulation and analysis. Factors that can influence transformation efficiency include the competence of the host cells, the quality and concentration of the plasmid DNA, the transformation method used, and the optimization of the transformation protocol. Understanding and maximizing transformation efficiency is essential for the successful execution of various molecular biology techniques, such as gene cloning, protein expression, and genetic engineering.
    • 6. Serial dilution
      Serial dilution is a fundamental technique in molecular biology and microbiology, used to prepare a series of dilutions of a sample or solution. This technique is particularly important in the context of transformation experiments, where it is used to determine the transformation efficiency by counting the number of colony-forming units (CFUs) on agar plates. By performing a serial dilution of the transformed bacterial cells, researchers can obtain a range of dilutions that allow for accurate quantification of the transformed cells. This information is crucial for calculating the transformation efficiency and evaluating the success of the transformation process. Understanding the principles and proper execution of serial dilution is essential for various applications, including microbial enumeration, enzyme activity assays, and the preparation of standard curves in analytical techniques.
    • 7. Plating
      Plating is a crucial step in transformation experiments, where the transformed bacterial cells are spread onto agar plates containing a selective medium. This process allows for the isolation and enumeration of the successfully transformed cells, which are able to grow and form colonies on the plates. The selective medium, often containing an antibiotic like ampicillin, ensures that only the transformed cells, which carry the resistance gene, are able to survive and proliferate. Proper plating techniques, such as ensuring an even distribution of the cells and using the appropriate volume of the cell suspension, are essential for obtaining accurate counts of the transformed colonies and calculating the transformation efficiency. Understanding the principles and best practices of plating is a fundamental skill in molecular biology and microbiology, as it enables the successful isolation and analysis of genetically modified organisms.
    • 8. SOC
      SOC (Super Optimal broth with Catabolite repression) is a specialized growth medium used in transformation experiments, particularly for the recovery and outgrowth of transformed bacterial cells. After the introduction of plasmid DNA into competent cells, the SOC medium provides the necessary nutrients and conditions for the cells to recover, express the antibiotic resistance gene, and begin dividing. The SOC medium is typically used for a short incubation period (e.g., 1 hour) before the cells are plated on selective agar plates. The components of SOC, such as glucose and various salts, support the metabolic processes and growth of the transformed cells, enhancing their survival and the overall transformation efficiency. Understanding the role and composition of SOC medium is crucial for optimizing the transformation protocol and ensuring the successful recovery and propagation of the transformed bacterial cells.
    • 9. Transformation protocol
      The transformation protocol is a standardized set of steps and procedures used to introduce foreign DNA, such as plasmids, into competent host cells, typically bacteria. This protocol involves various stages, including the preparation of competent cells, the mixing of the cells with the plasmid DNA, the heat shock or other methods to facilitate DNA uptake, and the subsequent recovery and plating of the transformed cells. The transformation protocol must be carefully followed to ensure the highest possible transformation efficiency and the successful integration of the plasmid DNA into the host cells. Understanding the principles, best practices, and potential pitfalls of the transformation protocol is essential for researchers working in the fields of molecular biology, genetic engineering, and biotechnology, as it underpins many fundamental techniques and experiments.
    • 10. Transformation result analysis
      Analyzing the results of a transformation experiment is a crucial step in evaluating the success and efficiency of the process. This analysis typically involves quantifying the number of transformed colonies that grow on selective agar plates, as well as assessing the quality and characteristics of the transformed cells. Key parameters to analyze include the transformation efficiency, calculated as the number of colony-forming units (CFUs) per microgram of plasmid DNA, and the phenotypic or genotypic properties of the transformed cells, such as the expression of the desired recombinant protein or the presence of the correct plasmid DNA. Careful analysis of the transformation results allows researchers to optimize the protocol, troubleshoot any issues, and ensure the successful execution of downstream experiments involving the transformed cells. Understanding the principles and best practices of transformation result analysis is essential for researchers working in the fields of molecular biology, genetic engineering, and biotechnology.

  • 자료후기

      Ai 리뷰
      본 실험에서는 DH5α competent cell을 사용하여 plasmid DNA의 transformation을 성공적으로 수행하였으며, 계산된 transformation efficiency가 기대치에 미치지 못한 원인을 분석하였습니다.

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