플라스미드 DNA 정제/ purification of plasmid DNA

소개

9.5/10 점 받은 생화학실험 보고서 입니다.
왜 깎였는지 교수님 피드백 들어있습니다.

목차

1. Summary
2. Introduction
3. Material and Methods
4. Result and Discussion
5. Reference

본문내용

1) Plasmid DNA 분리

Plasmid DNA는 재조합 DNA 조작을 위한 운반체 DNA로 사용되는데, 이 운반체 DNA를 Vector라고 한다. 주로 대장균에 vector를 삽입하는데 이 과정을 Bacterial Transformation이라고 한다. vector를 cell에 도입한 뒤, 선별을 위해 ampicillin이 함유된 배지에서 키우는 과정을 진행한다. ampicillin이 함유된 배지에서 자라난 colony는 Bacterial Transformation이 성공한 cell이다. 대장균 cell에는 plasmid DNA와 대장균 cell의 염색체 DNA인 chromosomal DNA가 독자적으로 존재하기 때문에 plasmid DNA를 따로 분리하여야 한다. cell에서 plasmid DNA를 따로 분리하는 과정을 Purification of plasmid DNA라고 한다. plasmid DNA 분리에는 boiling method, alkaline lysis, lithium based procedure 등 여러 방법이 있지만 가장 보편적으로 사용되는 mini-prep 방법은 alkaline lysis이다. 높은 pH의 알칼리성 용액을 사용하여 cell의 세포벽과 세포막을 용해시킨 후, 산성 용액을 처리하여 plasmid DNA만을 분리해내는 방법이다. 알칼리성 용액이 cell을 용해시키면 cell 안의 chromosomal DNA와 수확해야 할 plasmid DNA가 노출되어 변성이 일어나게 된다. 두 DNA 모두 변성이 일어나지만 산성 용액을 이용하여 용액을 중성으로 만들어주면 원래의 변성 전 상태로 복원이 된다. 하지만 chromosomal DNA는 크기가 크고 구조가 복잡하여 변성 전의 상태로 복원이 되지 못하고 침전이 되어 제거되며, plasmid DNA는 비교적 간단한 구조이기 때문에 원래 상태로 복원되게 된다. 분리가 끝난 plasmid DNA는 Electrophoresis를 통해 확인할 수 있다.

2) Alkali lysis

Alkali lysis는 mini-prep의 한 종류로 용액의 pH를 이용하여 plasmid DNA를 분리하는 방법이다. 여기서 mini-prep은 DNA purification의 한 종류로 mini는 DNA를 소량 추출한다는 뜻이며 prep은 preparation을 의미한다. Alkali lysis는 Re-suspension, Cell lysis, Neutralization, Cleaning and Concentration 순서로 진행하게 된다. Re-suspension 단계에서는 S1 buffer를 사용하게 되는데, 이 buffer는 glucose, EDTA(chelator), RNase, Tris 등이 함유되어 있다.

<중 략>

Nanodrop 분석 결과 4조는 1번 plasmid DNA는 농도가 다른 조에 비해 꽤 높은 편인 206.3 ng/µL가 나왔고 2번 plasmid는 다른 팀에 비해 DNA 농도가 낮은 편인 38.9 ng/µL가 나왔다.
A260/A280 비율의 수치는 단백질에 대한 핵산의 양을 나타낸다. 순수하게 정제된 RNA나 DNA는 각각 2.1과 1.8의 수치를 나타낸다. 비율이 낮을수록 단백질의 함량이 높다는 의미이며 높은 단백질 함량은 핵산을 이용하는 실험에 영향을 미칠 수 있다. 모든 조에서 A260/A280 비율은 1.8보다 높기 때문에 단백질 함량이 높지 않게 분리가 잘 되었다는 것을 알 수 있다.

참고자료

· 이종호 외 6명. 의생명과학 실험서. ㈜라이프사이언스. 2021년 9월 1일. 228-229P
· BiteSizeBio. Lab Basics: How The Alkaline Lysis Method Works. Alkali lysis. 2023-11-02.
· https://bitesizebio.com/180/the-basics-how-alkaline-lysis-works/
· 다인바이오. DNA 전기영동2. 전기영동. 2023-11-03.
· http://www.dynebio.co.kr/yc/bbs/board.php?bo_table=data1&wr_id=5&page=3
· 단국대학교 생리화학실험실. Plasmid DNA 분리. plasmid DNA purification. 2023-11-03.
· https://cms.dankook.ac.kr/web/biophysi/gene-cloning
· ThermoFisher. NanoDrop 분광광도계 리소스. nanodrop 사용법. 2023-11-03.
· https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/industrial/spectroscopy-elemental-isotope-analysis/molecular-spectroscopy/uv-vis-spectrophotometry/instruments/nanodrop/resources.html