서강대 현대생물학실험2 TA cloning, Mini prep, Enzyme cut

소개

서강대학교 현대생물학실험 2 "TA cloning, Mini prep, Enzyme cut"에 대한 내용입니다.

목차

1. Abstract
2. Intro
3. Materials and Methods
4. Result
5. Discussion
6. References

본문내용

1.Abstract
본 실험은 target gene을 T vector에 삽입하고 세포에 주입해 증폭시키는 TA cloning을 한 뒤 transformation이 성공적으로 이뤄졌는지 확인하기 위해 LacZ selection을 이용한다. 또한 transformation이 일어난 대장균 cell로부터 plasmid DNA를 추출하고 정제하기 위해 mini-scale preparation을 진행한다. Mini-prep은 resuspension step, lysis & denaturation step, neutralization & renaturation step, EthOH, isopropanol precipitation step의 총 4단계로 이뤄져 있다. 각 step은 세포막/벽을 약하게 하는 단계, alkaline 조건에서 DNA를 변성시키는 단계, pH를 중화시켜 plasmid DNA만을 renature시키는 단계, isopropanol, ethanol을 사용해 salt, 불순물을 제거해 plasmid DNA만을 얻는 단계이다. 이 mini-prep은 alkaline 조건에서 chromosomal DNA와 plasmid DNA의 변성정도가 다르고 chromosomal DNA가 plasmid DNA 보다 훨씬 크기 때문에 renature이 완전히 일어나지 않는 것을 사용한 방식이다. 이렇게 얻은 plasmid DNA와 pET21a vector는 HindⅢ와 NdeⅠ 제한효소를 이용해 enzyme cut을 진행한다. 실험 결과 LacZ selection에서는 white colony 34개가 관찰되었고 이 cell로부터 추출한 plasmid DNA의 전기 영동 결과 2.5 kb위치에서 band가 관찰 되었고 이는 supercoiled한 plasmid일 것이라고 추측했다. Enzyme cut한 mini-prep한 plasmid의 전기영동 결과는 약 3kb 위치와 0.75 kb 위치에서 두개의 band가 관찰됐고 각각 T vector와 insert DNA일 것이라고 추측했다. pET21a vector의 전기 영동 결과는 약 5.3 kb 위치에서 관찰되었고 이는 잘린 pET21a vector로 추정했다. Uncut이 multi band인 이유는 여러 형태의 DNA가 존재하기 때문이라고 추정했다. nanodrop으로 측정한 vector와 insert의 농도는 각각 27.955 ng/ul, 15.705 ng/ul였고 260/280(nm)은 1.98, 2.18로 insert DNA의 순도가 더 높은 것을 알 수 있었다.

참고자료

· Green MR, Sambrook J. Precipitation of DNA with Isopropanol. Cold Spring Harb Protoc. 2017 Aug 1;2017(8):pdb.prot093385. doi: 10.1101/pdb.prot093385. PMID: 28765297.
· David L. Nelson, Michael M. Cox & Aaron A. Hoskins(2023), 레닌저 생화학, 8th ed, 월드사이언스, pp. 285-286, 303-309
· T.A.Brown(2012), 유전자 클로닝과 DNA 분석, 제6판, 월드사이언스, pp.94-95, 111-113