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리포트 / 자연과학

서강대 현대생물학실험2 TA cloning, Mini prep, Enzyme cut

서강대학교 현대생물학실험 2 "TA cloning, Mini prep, Enzyme cut"에 대한 내용입니다.
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최초등록일 2023.12.08 최종저작일 2023.10
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서강대 현대생물학실험2 TA cloning, Mini prep, Enzyme cut
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    소개

    서강대학교 현대생물학실험 2 "TA cloning, Mini prep, Enzyme cut"에 대한 내용입니다.

    목차

    1. Abstract
    2. Intro
    3. Materials and Methods
    4. Result
    5. Discussion
    6. References

    본문내용

    1.Abstract
    본 실험은 target gene을 T vector에 삽입하고 세포에 주입해 증폭시키는 TA cloning을 한 뒤 transformation이 성공적으로 이뤄졌는지 확인하기 위해 LacZ selection을 이용한다. 또한 transformation이 일어난 대장균 cell로부터 plasmid DNA를 추출하고 정제하기 위해 mini-scale preparation을 진행한다. Mini-prep은 resuspension step, lysis & denaturation step, neutralization & renaturation step, EthOH, isopropanol precipitation step의 총 4단계로 이뤄져 있다. 각 step은 세포막/벽을 약하게 하는 단계, alkaline 조건에서 DNA를 변성시키는 단계, pH를 중화시켜 plasmid DNA만을 renature시키는 단계, isopropanol, ethanol을 사용해 salt, 불순물을 제거해 plasmid DNA만을 얻는 단계이다. 이 mini-prep은 alkaline 조건에서 chromosomal DNA와 plasmid DNA의 변성정도가 다르고 chromosomal DNA가 plasmid DNA 보다 훨씬 크기 때문에 renature이 완전히 일어나지 않는 것을 사용한 방식이다. 이렇게 얻은 plasmid DNA와 pET21a vector는 HindⅢ와 NdeⅠ 제한효소를 이용해 enzyme cut을 진행한다. 실험 결과 LacZ selection에서는 white colony 34개가 관찰되었고 이 cell로부터 추출한 plasmid DNA의 전기 영동 결과 2.5 kb위치에서 band가 관찰 되었고 이는 supercoiled한 plasmid일 것이라고 추측했다. Enzyme cut한 mini-prep한 plasmid의 전기영동 결과는 약 3kb 위치와 0.75 kb 위치에서 두개의 band가 관찰됐고 각각 T vector와 insert DNA일 것이라고 추측했다. pET21a vector의 전기 영동 결과는 약 5.3 kb 위치에서 관찰되었고 이는 잘린 pET21a vector로 추정했다. Uncut이 multi band인 이유는 여러 형태의 DNA가 존재하기 때문이라고 추정했다. nanodrop으로 측정한 vector와 insert의 농도는 각각 27.955 ng/ul, 15.705 ng/ul였고 260/280(nm)은 1.98, 2.18로 insert DNA의 순도가 더 높은 것을 알 수 있었다.

    참고자료

    · Green MR, Sambrook J. Precipitation of DNA with Isopropanol. Cold Spring Harb Protoc. 2017 Aug 1;2017(8):pdb.prot093385. doi: 10.1101/pdb.prot093385. PMID: 28765297.
    · David L. Nelson, Michael M. Cox & Aaron A. Hoskins(2023), 레닌저 생화학, 8th ed, 월드사이언스, pp. 285-286, 303-309
    · T.A.Brown(2012), 유전자 클로닝과 DNA 분석, 제6판, 월드사이언스, pp.94-95, 111-113

  • AI와 토픽 톺아보기

    • 1. TA Cloning
      TA cloning is a highly efficient and practical molecular cloning technique that leverages the natural properties of Taq polymerase to add adenine overhangs to PCR products. This method significantly simplifies the cloning process by eliminating the need for restriction enzyme digestion and ligation optimization, making it particularly valuable for researchers working with time constraints. The technique's straightforward protocol and high success rates make it an excellent choice for rapid cloning applications. However, the reliance on commercial vectors and the potential for non-specific amplification products can introduce complications. Despite these minor limitations, TA cloning remains an indispensable tool in molecular biology laboratories, especially for initial cloning steps and high-throughput applications where speed and reliability are paramount.
    • 2. Mini-prep (Mini-scale Preparation)
      Mini-prep plasmid preparation is an essential technique for rapid and cost-effective isolation of plasmid DNA from bacterial cultures. This small-scale method efficiently extracts plasmids while minimizing reagent consumption and laboratory waste, making it ideal for routine screening and analysis of multiple clones. The technique's simplicity and reproducibility have made it a standard procedure in molecular biology workflows. Modern mini-prep kits have further improved yield and purity, enabling direct use of extracted plasmids in downstream applications like sequencing and transformation. While mini-prep produces lower DNA quantities compared to maxi-prep methods, its efficiency for routine laboratory work and compatibility with automated systems make it invaluable for high-throughput screening and quality control in molecular cloning projects.
    • 3. Enzyme Cut (Restriction Enzyme Digestion)
      Restriction enzyme digestion is a fundamental technique in molecular cloning that enables precise DNA manipulation by cutting DNA at specific recognition sequences. This method provides researchers with remarkable control over DNA fragment generation and directional cloning strategies. The specificity and reliability of restriction enzymes make them indispensable for constructing recombinant DNA molecules with defined structures. However, successful digestion requires careful optimization of reaction conditions including buffer pH, temperature, and enzyme concentration. The cost of restriction enzymes and potential star activity under non-optimal conditions can present challenges. Despite these considerations, restriction enzyme digestion remains a cornerstone technique in molecular biology, offering unparalleled precision for creating compatible DNA ends and enabling sophisticated cloning strategies that would be difficult to achieve through alternative methods.
    • 4. LacZ Selection과 Transformation
      LacZ selection combined with transformation represents a powerful and elegant system for identifying successful recombinant clones through blue-white screening. This classical approach exploits the disruption of lacZ gene function when foreign DNA inserts into the multiple cloning site, allowing researchers to visually distinguish recombinant from non-recombinant colonies. The simplicity and cost-effectiveness of this selection method have made it a standard in molecular cloning laboratories for decades. The transformation process efficiently introduces recombinant plasmids into competent bacterial cells, enabling rapid propagation of desired constructs. While modern alternatives like antibiotic resistance markers and fluorescent proteins offer additional advantages, the LacZ system remains highly relevant for educational purposes and routine cloning work. The combination of reliable transformation protocols with intuitive visual selection makes this approach accessible to researchers at all experience levels.

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