5주차_Transformation 레포트

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목차

I. Purpose

II. Theory
1. Competent cell (DH5α)
2. Plasmid DNA
3. Ampicillin resistance
4. Transformation
5. Transformation efficiency
6. Serial dilution
7. Plating (spreading)
8. SOC

III. Apparatus/reagent

IV. Procedure
1. Transformation
2. Plating

V. Data&Results

VI. Discussion

본문내용

Purpose: E.coli의 transformation을 진행하고, transformation efficiency를 계산한다.

Theory
1. Competent cell (DH5α)
일반적으로, 박테리아가 외부의 DNA를 받아들이는 것은 매우 제한적이기 때문에 형질전환 은 효율적으로 일어나지 않는다. 따라서, 형질전환을 위해서는 외부의 DNA를 보다 효율적으 로 받아들일 수 있도록 변형된 cell이 필요한데, 이를 competent cell이라고 한다. 실험실에서 자주 사용되는 competent cell에는 BL21과, DH5α가 있다. 먼저 BL21은 ompT protease가 mutation되었기 때문에 단백질 분해효소가 기능을 잃는다. 그리고, 이번 실험에서 사용하는 DH5α는 recA1의 160번 자리가 Glycine에서 aspartic acid로 mutation되어 endonuclease가 기 능을 잃고, 재조합효소 활성이 억제된다. 즉, DH5α는 삽입된 plasmid를 분해하지 않는다는 장 점을 갖는다.

2. Plasmid DNA
plasmid는 extrachromosomal DNA 분자로, chromosonal DNA와는 물리적으로 분리되어 독 립적으로 복제될 수 있다. 주로 환형의 이중나선 DNA 분자로 박테리아에서 관찰된다. 염색체 는 주로 일반적인 환경에서 생존할 때 필수적인 중요한 유전정보를 포함한다. 하지만, plasmid 는 작고 부수적인 gene을 포함한다. 이러한 정보는 특별한 환경에서 유용성을 갖기도 한다. 예를 들어 자연에서 plasmid는 유기체의 생존과 항생물질 내성에 관여하며, 하나의 박테리아 에서 다른 박테리아로 conjugation을 통해 전달될 수 있다(horizontal gene transfer). 분자 cloning에서 인공 플라스미드는 vector로 사용된다.

참고자료

· Jeremy M.Berg, Biochemistry, 8th, W. H. Freeman, 2015, pp872-874, p924
· B. Alberts, Molecular Biology of the Cell, 6th, Garland Science, 2014, pp267-269, pp278-300
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- 1. Competent cell (DH5α)
  
  Competent cells, such as DH5α, are a crucial component in molecular biology and genetic engineering. These cells have been genetically modified to be highly receptive to foreign DNA, making them ideal for transformation experiments. DH5α cells are commonly used due to their high transformation efficiency, which allows for the successful incorporation of plasmid DNA into the bacterial cells. This property is particularly important in various applications, such as cloning, protein expression, and genetic manipulation. The ability of DH5α cells to efficiently take up and maintain plasmid DNA is a valuable tool that enables researchers to study gene function, produce recombinant proteins, and develop new biotechnological applications. The use of competent cells like DH5α has significantly advanced our understanding of molecular processes and has contributed to numerous advancements in the field of biotechnology.
- 2. Plasmid DNA
  
  Plasmid DNA is a crucial component in molecular biology and genetic engineering. Plasmids are small, circular DNA molecules that exist independently of the host cell's chromosomal DNA and can be easily manipulated and replicated. They serve as valuable tools for various applications, such as gene cloning, protein expression, and genetic modification. Plasmids often carry genes that confer specific traits, such as antibiotic resistance, which allows for the selection and maintenance of transformed cells. The ability to insert foreign DNA into plasmids and introduce them into host cells, such as bacteria or yeast, enables researchers to study gene function, produce recombinant proteins, and develop new biotechnological applications. The versatility and ease of use of plasmid DNA have made it an indispensable tool in modern molecular biology, contributing to significant advancements in fields like medicine, agriculture, and environmental science.
- 3. Ampicillin resistance
  
  Ampicillin resistance is a crucial feature in molecular biology and genetic engineering. Many plasmids used for cloning and genetic manipulation carry the ampicillin resistance gene, which allows transformed cells to survive and grow in the presence of the antibiotic. This resistance is conferred by the production of the enzyme beta-lactamase, which inactivates ampicillin, enabling the transformed cells to proliferate. The use of ampicillin resistance as a selectable marker is essential for the identification and isolation of successfully transformed cells, as only those cells that have taken up the plasmid will be able to grow on media containing ampicillin. This selection process ensures the enrichment of the desired recombinant cells, facilitating downstream experiments and applications. The widespread use of ampicillin resistance in molecular biology has contributed to numerous advancements in fields such as biotechnology, medicine, and agriculture, where the ability to manipulate and study genetic material is crucial.
- 4. Transformation
  
  Transformation is a fundamental process in molecular biology and genetic engineering, where foreign DNA is introduced into a host cell, such as bacteria or yeast. This process allows researchers to incorporate desired genetic material, such as plasmids or recombinant DNA, into the host cell, enabling the expression of specific genes or the production of recombinant proteins. Transformation is a crucial step in many applications, including gene cloning, protein expression, and genetic modification. The successful transformation of competent cells, such as DH5α, is often facilitated by the use of selectable markers, like antibiotic resistance genes, which allow for the identification and isolation of transformed cells. The ability to efficiently transform host cells and maintain the introduced genetic material has been instrumental in advancing our understanding of molecular processes and has enabled numerous breakthroughs in fields like medicine, agriculture, and biotechnology.
- 5. Transformation efficiency
  
  Transformation efficiency is a critical factor in molecular biology and genetic engineering, as it determines the success rate of introducing foreign DNA into host cells. Transformation efficiency refers to the number of transformed cells obtained per unit of DNA used in the transformation process. High transformation efficiency is desirable, as it allows researchers to work with a larger population of transformed cells, increasing the chances of obtaining the desired genetic modifications or recombinant proteins. Factors that influence transformation efficiency include the competence of the host cells, the quality and quantity of the DNA being introduced, and the optimization of the transformation protocol. Competent cells, such as DH5α, are engineered to have a high transformation efficiency, making them valuable tools in various applications, including gene cloning, protein expression, and genetic manipulation. The ability to achieve high transformation efficiency is crucial for the success of many molecular biology experiments and has contributed to significant advancements in fields like biotechnology, medicine, and agriculture.
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