[생명공학 레포트] Genome editing / knockout 벡터 확립 및 도입

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Genome Editing은 생명체의 특정 염기서열을 교정하거나 편집하는 기술을 의미한다. 이러한 Genome editing 기술에는 과거부터 이용되었던 Zinc finger nucleases나 TALEN을 이용하는 방법이 있었으나 현재는 높은 정확도와 효율성을 갖추고, 비교적 쉽게 디자인할 수 있는 기술인 CRISPR을 주된 tool로써 사용하고 있다.
현재 주로 이용되는 Genome Editing은 3세대 기술로 CRISPR/Cas9을 이용하는 기술이다. 여기서 CRISPR란 박테리아 같은 prokaryotic organism에서 발견되는 DNA sequences로서 이 서열은 이 박테리아에 침입 했었던 박테리오파지의 DNA 조각으로부터 얻어진다. 박테리아는 이후에 비슷한 파지가 침입했을 때 CRISPR을 이용해 새로 침입한 파지의 염기서열과 대조하고 그것을 파괴하는 후천적 면역시스템을 갖추고 있다. 이때 DNA 서열을 절단하는 역할을 하는 enzyme(nuclease)이 Cas9이다. 정리하자면 CRSIPR라는 DNA fragment와 enzyme인 Cas9이 작동하여 과거의 침입했던 데이터가 존재하는 파지의 DNA 서열을 절단하는 역할을 한다고 할 수 있다. 이를 응용한 기술인 CRISPR/Cas9 에서는 효소가 절단하는 부분의 염기서열을 guide RNA(gRNA)로서 인위적으로 제공해주어 원하는 부분의 DNA를 절단하도록 한다. 이를 이용해 특정 gene을 knock-in을 시키는 작업을 수행 할 수 있다. 이 기술은 앞선 세대의 기술들보다 훨씬 싸고 높은 정확성을 가지며 쉽기 때문에 현재 가장 많이 사용되고 있는 기술이다.
본 실험에서는 CRISPR/Cas9을 이용한 Genome Editing의 방법에 대해서 알아 볼 것이다. 우선 Genome Editing 기술을 이용해서 삽입하고자 하는 double stranded guide DNA를 먼저 제작해야 한다.

참고 자료

Barrangou R, The roles of Crispr-Cas systems in adaptive immunity and beyond. Current Opinion in Immunology, 2015
Tae Kyung Kim, James H. Eberwine, Mammalian cell transfection: the present and the future(Anal Bioanal Chem, 2010)
F. L. Graham, A. j. Van Der EB, A New Technique for the Assay of Infectivity of Human Adenovirus 5 RNA(Virology, 1973)
Anzalone Andrew V, Randolph Peyton B, Davis Jessie R, Sousa Alexander A, Koblan Luke W, Levy Jonathan M, Chen, Peter J, Wilson Christopher, Newby Gregory A, Raguram Aditya, Liu David R., Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA(Nature. vol 576, 2019),