서강대학교 현생실1 6x his tagged eGFP 단백질의 발현 및 정제

소개

"서강대학교 현생실1 6x his tagged eGFP 단백질의 발현 및 정제"에 대한 내용입니다.

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Materials and Methods
4. Results
5. Discussion
6. References

본문내용

이번 실험에서는 단백질을 정제하고 그 정량적 특성과 정성적 특성을 여러 방법을 통해 알아보았다. 단백질 정량을 위한 방법으로는 Spectrophotometry를 통한 Extinction coefficient assay와 Lowry assay를 사용했다. Spectrophotometry는 Sample안에 있는 단백질이 특정파장에서 빛을 흡수하는 성질을 토대로 단백질을 정량 하는 것이고, Lowry assay는 Biuret method에서 변형시킨 실험방법으로, 용액에 존재하는 단백질의 양을 측정하는 방법이다. 측정하고자 하는 용액의 색변화를 통해 단백질의 농도를 알 수 있으며, Cu2+가 Folin-Ciocalteu 반응하는 것을 원리로 한다. Spectrofluorometer를 통해 Excitation과 Emission에서의 파장특성을 통해 정제한 단백질의 특성을 알아보았다. Sonication을 통해 Cell을 파괴하고 Affinity Chromatography를 통해 단백질을 Elution하여 정제된 형광단백질 eGFP를 얻었으며, 이를 Ultrafiltration을 통해 불순물을 제거하고, SDS-PAGE를 통해 DNA의 Size를 알아보았다. 그 결과 일반적인 eGFP에 대한 DNA Band가 나왔으며, Lowry assay를 통해 농도를 측정한 뒤 Spectrofluorometery를 통해 eGFP가 맞는지 그래프를 통해 확인하였다. eGFP를 Extinction coefficient assay와 Lowry assay로 정량한 결과, Extinction coefficient assay의 eGFP 농도가 Lowry assay의 결과보다 약30%정도 적게 나타난 것을 볼 수 있었으며, 이것은 eGFP의 흡광 특성상 Lowry assay가 보다 정확한 정량방법이기 때문이다. 또한 Spectrophotometry와 Spectrofluorometry를 통한 결과 그래프의 차이를 관찰하고 그 원인을 분석하고, 각각의 실험에서 eGFP의 농도에 대한 오차요인을 분석함으로 이 실험을 진행하였다.

참고자료

· Campbell et al. (2016), Biology, 11th edit., New York : Pearson, p.81.
· The QIAexpressionistTM A handbook for high-level expression and purification of 6x His-tagged proteins.
· Holder, A. N., Ellis, A. L., Zou, J., Chen, N., & Yang, J. J. (2009). Facilitating chromophore formation of engineered Ca(2+) binding green fluorescent proteins. Archives of biochemistry and biophysics, 486(1), 27–34.
· David L. Nelson, Michael M. Cox, Lehninger’s Principles of biochemistry, W.H. Freeman, 2004, p.80.