플라스미드(plasmid) DNA의 분리(Isolation) : 알칼리 세포파괴법(Alkaline lysis)

소개

Alkaline lysis 방법은 세균 세포를 먼저 SDS(이온성 계면활성제 및 단백질 변성제: 세포막의 지질 성분을 용해시켜 세포막 파괴) 및 NaOH (alkali)로 처리하여 세균 세포를 부수는 동시에 DNA 염기쌍의 수소결합을 파괴하여 이중나선 구조를 분리시킨다. 이어서 산성 용액(potassium acetate)을 가하여 중화시키면, 염색체 DNA는 크기가 너무 커서 변성 전의 정상의 상태로 복원되지 못하고 더욱 엉키게 된다. 염색체 DNA와 단백질은 potassium과 SDS간에 형성되는 complex 속에 갇혀 흰색의 침전물로 가라앉는다. 반면 크기가 작고 공유결합으로 연결되어 있는 supercoiled plasmid DNA는 정상적으로 복원이 되어 용액에 녹아 상등액에 남게 된다. 이 방법은 plasmid DNA와 염색체 DNA간의 구조적 차이에 기인하여 plasmid DNA만을 분리하는 방법이다.

목차

1. title : Isolation of Plasmids (pET15bm)

2. Abstract

3. Principle
⑴ What is the Plasmid ?
⑵ RNA is structurally very similar to DNA. How can you remove RNA during plasmid isolation?
⑶ How do you break the cell membranes ?
⑷ What is the role of ethanol in the current experiment?
⑸ How do you determine the concentration of the plasmid isolated using UV/Vis spectrometry?
⑹ What is the role of phenol in the phenol in the phenol extraction (a clssical method) for plasmid purification ?

4. Material and method
⑴ Material
⑵ Method 1. Alkaline Lysis
2. DNA 농도의 결정
* UV/Vis spectroscopy
* Nanodrop

5.Result

6.Discussion
(1) DNA 농도
(2) DNA 순도
(3) 고찰
(4) 그 외의 방법 : boiling 방법 (alkaline lysis처럼 miniprep의 한 방법)

7. Reference

본문내용

1. title : Isolation of Plasmids (pET15bm) -Protocol 1. Miniprep: 알칼리 세포파괴 방법에 의한 플라스미드 DNA의 분리

2. Abstract Alkaline lysis 방법은 세균 세포를 먼저 SDS(이온성 계면활성제 및 단백질 변성제: 세포막의 지질 성분을 용해시켜 세포막 파괴) 및 NaOH (alkali)로 처리하여 세균 세포를 부수는 동시에 DNA 염기쌍의 수소결합을 파괴하여 이중나선 구조를 분리시킨다. 이어서 산성 용액(potassium acetate)을 가하여 중화시키면, 염색체 DNA는 크기가 너무 커서 변성 전의 정상의 상태로 복원되지 못하고 더욱 엉키게 된다. 염색체 DNA와 단백질은 potassium과 SDS간에 형성되는 complex 속에 갇혀 흰색의 침전물로 가라앉는다. 반면 크기가 작고 공유결합으로 연결되어 있는 supercoiled plasmid DNA는 정상적으로 복원이 되어 용액에 녹아 상등액에 남게 된다. 이 방법은 plasmid DNA와 염색체 DNA간의 구조적 차이에 기인하여 plasmid DNA만을 분리하는 방법이다.

3. Principle⑴ What is the Plasmid ? 플라스미드란 세포 내에서 발견되는 염색체 외의 이중가닥 DNA로서 독립적 복제 능력을 가지는 유전인자들의 집합체이며 염기쌍의 수가 수천에서부터 수십만까지 그 크기가 다양하다. 주로 항생물질에 대한 저항성을 나타내는 유전자를 포함하고 있다. 대부분 환형 분자이나 일부 박테리아는 선형 플라스미드를 가지고 있고, 그람양성 박테리아의 플라스미드는 정상적인 복제과정과는 다소 다른 회전환 복제과정을 거치기 때문에 단일가닥 DNA가 많이 생기게 된다. 복사본수(copy number)는 플라스미드마다 다르고 박테리아 세포는 한 종류 이상의 플라스미드도 가질 수 있다. 예를 들면, 세포 하나가 두 가지 다른 유형의 플라스미드를 가질 수 있는데, 한 플라스미드는 복사본이 수백 개이지만 다른 유형은 복사본이 단지 한 개뿐일 수 있다.

참고자료

· 최신 실험 미생물학; Editor, 미생물 및 면역학 분과회. Eds.; 1st ed; 신일상사, 2001; pp107-110⑵ 응용 미생물학 실험; Editor, 유주현.; Editor 변유량. Eds.; 1st ed; 효일, 2007; pp210-224
· Molecular Genetics of Bacteria; Editor, Larry.S. ; Editor, Wendy. C., Eds.; 2nd ed; ASM Press, 2003; pp 159-000.
· 최신 미생물실험; Editor, 오계헌. Eds.; 1st ed; 신광 문화사, 2005; pp235