Affinity Chromatography(친화성 크로마토그래피)를 통한 단백질 분리와 SDS-PAGE를 통한 분리 단백질 확인

소개

생화학 실험 중 Affinity Chromatography를 이용해 단백질을 분리하고,
SDS-PAGE를 통해 분리한 단백질을 확인하는 실험입니다.
또한 BCA법을 이용해 분리한 단백질의 농도까지 계산하였기 때문에
레포트 하나에 총 3가지 실험에 대해 다루었습니다.
따라서 3가지 실험 모두에 대한 정보가 필요하신 분에게 굉장히 유용한 자료가 될 것이고,
각각의 실험에 대한 이론, 방법, 실험기구, 결과, 고찰을 모두 수록하였으므로,
세 가지 실험 중 일부만 필요하신 분에게도 충분히 도움이 될 것으로 생각됩니다.
미리보기는 실험원리, 실험기구, 실험방법에 대한 페이지를 수록하였으니 참고하시기 바랍니다.

목차

1. Title

2. Introduction(실험원리)

3. Exeperimental
1) Materials & Apparatus
2) Method

4. Results

5. Discussion

6. Reference

본문내용

1) Affinity Column Chromatography를 통한 단백질 정제
이번 실험에서 정제할 단백질은 IDO(Indoleamine 2,3-dioxygenase)라는 효소이다. 이 효소는 L-Tryptophan을 N-formylkynurenine으로 전환시킨다. 실험에 사용하는 IDO는 recombinant DNA를 E.coli에 transformation하여 발현시킨다. E.coli는 gram negative bacteria로 cell wall 외부에 outer membrane이 있어 발현 된 Protein을 세포 밖으로 분비하지 않기 때문에 Protein을 정제하기 위해서는 세포를 파쇄해야 한다. 세포파쇄(cell disruption) 방법에는 기계적인 방법과 비기계적인 방법이 있다. 기계적인 방법에는 초음파 분쇄(sonication), 압착(press), 구슬 분쇄(bead mill) 방법 등이 있고 비기계적인 방법에는 lysozyme, freezing & thawing, osmotic shock 등의 방법이 있다. 세포를 파쇄하여 얻은 세포내 내용물의 혼합용액을 crude extract라 하며 이 것을 affinity column chromatography 하여 원하는 protein을 정제한다.
Affinity column chromatography는 서로 생물학적으로 높은 특이적 친화성을 갖는 2종류의 물질 중 한 쪽을 고정상으로 사용하여 그 고정상에 대한 친화성 차이를 이용해 목적물질과 불순물을 분리하는 chromatography이다. 예를 들어 효소와 기질(또는 inhibitor), 항원과 항체, 호르몬과 수용체, 핵산의 염기쌍 등의 사이에 작용하는 특이적 상호작용을 이용하여 상호작용 물질의 한 쪽을 불용성 담체에 공유결합 시킨 것을 고정상으로 이용한다. Affinity chromatography는 Amino acid D 및 L체의 분리, 생체고분자, 바이러스 등의 분리 또는 특이적 상호작용의 해석 등에 이용한다.

참고자료

· 한국 생화학회, 실험생화학 3판, 탐구당
· David L. Nelson, Michael M.cox, Lehninger Principles of biochemistry 5판, worldscience
· Donald Voet, Judith G.Voet, Charlotte W.Pratt, Principles of Biochemistry, 4판, Wiley John+Sons