Protein purification and identification

소개

위 자료는 카이스트 생물학실험 보고서입니다.

목차

Ⅰ. Objective
Ⅱ. Introduction
Ⅲ. Material
Ⅳ. Method
Ⅴ. Result
Ⅵ. Discussion

본문내용

Ⅰ. Objective
- 발현이 확인된 단백질을 정제 할 수 있고 단백질 농도를 정량할 수 있다.
Ⅱ. Introduction
1. Protein purification
1) 정제 방법
A) 단백질의 분쇄 및 원심분리
(1) Homogenizer
- 시료의 충분한 혼합, 교반, 분쇄에 사용되는데 시료속에서 dispersing shaft가 회전할 때 dispersing shaft의 끝부분의 rotor구멍으로 시료가 강하게 빨려 들어가 stator사이에서 혼합되어 높은 압력으로 수평 또는 수직으로 분산되어 혼합된다. 시료의 입자크기, 점도에 따라 rotor와 stator를 선택하여 사용하며 회전속도는 5,000～45,000rpm 이므로 적절한 회전속도를 이용한다.
(2) Centrifuge
- 물질에 고도의 원심력을 걸어줄 경우 각 물질의 질량 또는 밀도에 따라 원심력 내에서 이동 속도가 다름을 이용하여 물질을 분리한다.

<중 략>

1. Protein purification
- Column이 20% EtOH에 보관되어 있기 때문에 Volume의 5배만큼을 D.W로 washing을 한다.
- Column의 5배의 volume만큼을 binding buffer로 equilibration한다.
- Purification할 단백질 sample을 넣는다.
- Column의 10배의 volume만큼의 washing buffer로 washing을 한다.
- Column의 10배 만큼의 elution buffer를 넣고 elution한다. 이때 1ml 씩 microtube에 받는다.
2. Protein identification
- BSA를 계단희석을(0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1mg/ml) 하여 standard sample을 준비한다.
- Bradford reagent의 5배 희석시킨 1ml와 standard sample 각각 20ul 혼합한다.
- 또한 Bradford reagent의 5배 희석시킨 1ml와 정량할 sample을 20ul 혼합한다.
- 분광광도계를 이용하여 Bradford reagent로 파장 595nm에서 blank를 잡는다.
- Standard Curve를 그리고 이를 이용해 샘플의 단백질양을 추정한다.

참고자료

· 없음