cDNA합성

소개

cDNA

목차

1. 서론
1.1 실험목적
1.2 이론적 배경
1.2.1 Real time PCR
1.2.2 Real time PCR 원리
1.2.3 Real time PCR 방법
1.2.4 Real time PCR 응용
1.2.4 cDNA(complementary DNA)

2. 실험방법 및 기구
2.1 실험기구 및 시약
2.2 실험방법
2.2.1 RNA extraction
2.2.2 cDNA synthesis
2.2.3 Analysis of RNA, cDNA
2.2.4 Real time PCR

3. 결과
3.1 Quantitation of cDNA
3.2 Real time PCR

4. 토의

5. 참고자료

본문내용

1. 서론
1.1 실험 목적
같은 식물을 저온과 실온에서 보관후 각각 stoot부분과 root부분의 RNA를 추출하여 특정 유전자를 cDNA로 만들고 Real time PCR을 통해 특정 유전자 발현량을 비교하는 실험을 한다.

1.2 이론적 배경
1.2.1 Real-time PCR
PCR은 DNA의 열에 대한 특성과 고열에 내성을 가진 DNA polymerase를 응용하여 DNA의 특정부분을 필요한 양만큼 복제하는 기술로 수백 ~ 3kbase의 길이를 복제할 때 주로 사용한다. PCR은 DNA sequence 의 copy 수를 기하급수적으로 증폭시키는 것이 가능하며 DNA molecule의 어느 부분이든지 그 border sequence만 알면 증폭을 시킬 수 있다.
그 중에서 Real-Time PCR은 PCR 증폭과정 중에 발색되는 형광색소의 양을 실시간 별로 측정하여 정량 하는 방법이다. Primer외에도 특이 probe가 필요하며, Real time PCR을 위해서는 thermal cycler와 분광 형광 광도계를 일체화한 장치가 필요하다.

<중 략>

2. 실험 방법 및 기구
2.1 실험기구 및 시약
보리의 저온,실온 상태의 shoot, root. 막자사발 & 막자, RLT buffer, spin column, 원심분리기, RNase -free water, transcriptor first strand cDNA Synthesis Kit. Roche사
SYBR Green supermix, real-time PCR, spectrophotometer.

2.2 실험방법
2.2.1 RNA extraction
1. 80㎎ 이하의 식물조직을 준비한다.
2. 무게를 잰 조직을 액체질소에 넣고 막자사발과 막자를 이용하여 갈아준다. 갈아준 뒤에는 조직을 녹이지 않은 채로 2㎖ tube에 담아준다
3. 450㎕의 RLT buffer를 넣고 vortexing해 준다.
4. 용해물을 spin column(보라색)에 옮겨 담은 뒤, 2분 13000rpm에서 원심분리 한다. 그 후 조심스럽게 하층액 460㎖을 새로운 1.5㎖ tube에 옮긴다.
5. 0,5volume의 ehtanol(96~100%)을 넣고 pipetting으로 조심스럽게 섞어준다.
6. 섞어준 용액을 spin column(분홍색)에 옮겨준다. 그 후 뚜껑을 조심스럽게 닫고 100000
rpm 15초 원심분리한다. 이후 남겨진 하층액은 버린다.

참고자료

· ｏ http://www.jpnc.co.kr/gmo/dna_2.htm
· ｏ http://env1.gist.ac.kr/lab/EBL/eco_hp.htm
· ｏ http://ieet.postech.ac.kr/html/ieet_euip_30.htm
· ｏ http://sclab.co.kr/ko/menu2/m7-2.htm?num=8
· ｏ http://nexgenbiotech.com/product/product2_02.htm