Preparation of Plasmid DNA

소개

여러 방법 중 alkalin lysis법을 이용하여 E.coli의 plasmid DNA를 Isolation한다.

목차

실험 목적
이론
- alkalin lysis
- function of solution
- phenol estract and silica membrane
실험재료
실험 기구 및 장치
실험방법(내가 조사한)
추가이론조사
실험방법(plasmid DNA mini prep)
실험결과
결과분석
참고문헌

본문내용

실험목적
여러 방법 중 alkalin lysis법을 이용하여 E.coli의 plasmid DNA를 Isolation한다.

이론
1. Alkalin lysis법
Plasmid DNA를 소량 분리할 때 가장 일반적으로 쓰이는 분리방법이다. Plasmid DNA는 plasmid를 지니고 있는 박테리아에서 적은 양의 배양으로 분리될 수 있다. 박테리아는 sodium bodecyle sulfate(SDS), NaOH를 함유하는 용액으로 처리하여 용균된다. 여기서 SDS는 박테리아 단백질을 변성시키며 NaOH는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 변성시킨다. 다른 potassium acetate를 첨가하여 혼합액을 중성화시키는데 이것은 covalently closed plasmid DNA를 빠르게 reanneal시킨다.
Chromosonal DNA와 박테리아 단백질의 대부분은 침전되며 침전물은 원심분리로서 제거할 수 있다. Plasmid DNA는 상등액에 남아있게 되고 ethanol precipitation으로 집중시킬 수 있다.

1) 세포벽을 깬다. 이 때 세포막은 유지되도록 한다. 세포벽을 군데군데 무너뜨리는 데에는 EDTA이며, 이때 sucrose나 glucose가 첨가되어 세포의 형태를 유지하도록 한다. 때로는 lysozyme을 쓰기도 한다.
2) 세포막을 조심스럽게 깨서 DNA를 용액에 노출시킨다. (크기가 큰 chromosomal DNA가 너무 잘게 조각나는 것을 방지하기 위함) SDS라는 detergent가 세포막을 녹여버리면서 안에 있던 세포 내용물이 용액으로 흘러나온다. 이때 바로 alkali용액에 노출된 dNA는 모두 denature된다. 그러나 크기가 작은 supercoild plasmid DNA는 그다지 심각하게 denature되지 않는다.
3) pH를 급격히 7.0까지 복구시키면 크기가 작고 supercoiled form을 유지하고 있는 plasmid는 비교적 renaturation이 잘 되지만 chromosomal DNA는 미처 renature되지 못하고 엉기가 된다. 이렇게 엉긴 chromosomal DNA를 원심분리로 제거한다. 그러면 상층액에 plasmid DNA가 있게 된다.

참고자료

· T.A. Brown/ 유전자클로닝입문/ 월드사이언스/ 2000/
· DNA프로필연구회/유전자감식/ 탐구당/ 2002
· http://blog.naver.com/yiminari?Redirect=Log&logNo=20152217924
· http://blog.naver.com/bsi1223?Redirect=Log&logNo=90097291791
· http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_molecular/gene_cloning_20.php
· http://bitesizebio.com/articles/the-basics-how-phenol-extraction-works/
· Technical Note: Improved DNA Extraction From Ancient Bones Using Silica-Based Spin Columns/ 1998/ AMERICAN JOURNAL OF PHYSICAL ANTHROPOLOGY / 105 / p.539–543