포항공대 화학생명공학실험[포스텍 A]Final-Report (Ligation & Transformation ,Mini-preparation of Plasmid DNA)

소개글

포항공대 화학공학과 전공필수 과목인 화학생명공학실험 보고서입니다
PRE-Report 는 실험전 사전지식을 정리하는 보고서이고 Final-Report는 실험후 결과를 정리하는 보고서 입니다.
두가지를 모두 참고하셔서 과제에 도움이 되시길 바랍니다.

목차

1. Whole summary for Cloning
2. Primer Design
3. 참고문헌

본문내용

1. Whole summary for Cloning
지금까지 화학생명공학 실험에서 cloning에 관련된 중요한 개념은 크게 5가지로 나눌 수 있다. PCR, Ligation, Transfomation, Mini-prep, restriction 이 5가지이다. 먼저 PCR은 우리가 원하는 template DNA를 복제하기 위해 사용하는 기술이다. 단순히 ‘염기서열’ 만을 복제하기 위한 기술이므로, 세포나 vector가 따로 필요하지는 않고 세포 내부와 비슷한 환경만 제공해주면 된다. Primer, polymerase, dNTPs 가 그것이다. 우리는 template로 Ds-Red를 사용하였고 taq polymerase를 중합효소로 이용했다. Taq polymerase를 쓰는 이유는 고온에서도 변성이 잘 안되기 때문이다. PCR을 하는 이유는 template의 농도를 크게 높여서 ligation이 잘 되게 하기 위해서이다. PCR을 하고 나서 전기영동으로 올바르게 복제가 되었는지 확인하기도 한다. 두 번째, Ligation은 PCR로 왕창 불려놓은 insert와 vector를 연결하는 과정이다. 이 때 두 가지의 vector를 사용했는데 pGEM-T Easy와 pET22b(+) 이다. 두 vector는 쓰임이 다른데 ‘복제’ 자체가 목적이라면 전자를, 단백질 발현이 목적이라면 후자를 사용한다. 실험 과정 중간에 보면 굳이 ligation이 되어있는 상태에서 restriction enzyme을 사용해 끊어내고 다시 새로운 vector에 연결하는 과정이 있다.

참고 자료

Sambrook et al Molecular Cloning 3rd Ed. Vol.1 Chapter 1
Vogelsten et al Preparation and analytical purification of DNA from agarose. PNAS 1979,76, 615-619
1998 Biochemical Catalog”, Boehringer Mannheim