[생화학실험] plasmid purification과 전기영동

소개

[생화학실험] plasmid purification과 전기영동

보고서 입니다. 원리 및 실험방법의 자세한 설명이 되어 있으니 많은 참고 바랍니다.

목차

1. 실 험 목 적
2. 실 험 원 리
3. 시 약 및 기 구
4. 실 험 방 법

본문내용

1. 실험 목적
 Plasmid DNA의 원형을 유지하는 구조적 특징을 이용하여 Alkaline lysis product를 이용하여 Plasmid DNA를 분리한다.
 DNA Purification 한 것을 Agarose Gel 전기 영동을 통해 DNA를 크기 별로 분리하여 확인한다.

2. 실험 원리
☀ Plasmid Purification ☀

 플라스미드란?
- 염색체 DNA와는 독립적으로 존재 하는 환형의 DNA
- 독립적으로 복제 할 수 있도록 하는 자기 복제 기점(Ori)을 갖고 있다.

 들어가면서
- 주로 mini prep이라고 부르는 이 방법은 plasmid DNA를 소량 분리하는 방법.
- 가장 보편적으로 사용되는 방법인 Alkali lysis method를 사용한다.
- 기본적인 원리는 세균의 cell wall과 cell membrane을 부수고 DNA 만을 분리하는 것
- 중요한 것은 세균이 원래 가지고 있는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 구분하여 분리하는 것
- 이 둘은 모두 DNA이므로 성질이 비슷하기 때문에 구분하여 분리하기가 쉽지 않지만, 다행히 chromosomal DNA는 분리 과정에서 linear 형태가 되고 크기가 상당히 크기 때문에 이런 성질의 차이를 이용하면 분리가능!!

 플라스미드의 분리정제

① 균이 가득 자란 액체배지를 microfuge tube에 옮겨 담고 원심분리한다.

②용액 1 첨가 =>세포 덩어리를 풀어준다.
- 용액 1 (25 mM Tris-Cl ,pH 8.0,10 mM EDTA, 50 mM glucose )
- 뭉쳐진 균을 풀어주어 solution II가 모든 세균에 균일하게 처리될 수 있도록 한다.
- Tris : pKa = 8.06으로 pH 7.0~9.2 사이에서 완충용액으로 효과적으로 작용
- EDTA : 세포벽의 integrity를 유지하는 데 필수적인 calcium ion을 제거하여 세포벽을 깨뜨린다.
- DNA를 변형시키는 효소들은 magnesium과 같은 2가 이온을 필요로 하므로 EDTA 를 조금 넣어주면 이런 효소들로부터 DNA를 보호할 수 있다.
- glucose : 삼투압을 유지시켜 세포의 외형을 유지시켜 준다. vortex를 해야 하는데 이때 세포가 완전히 깨지게 되면 chromosomal DNA가 잘게 깨지게 되어 plasmid DNA와 구분할 수 없게 된다.
- 따라서 이렇게 세포를 유지시켜가면서 세포벽만 깨는 것!! (세포막은 유지)

참고자료

· 없음