[유전학] DNA mini prep

소개

유전학 DNA mini prep 실험레포트입니다 A+받앗습니다.

Plasmid DNA 분리의 기본적인 원리는 세균의 cell wall 과 cell membrane 을 부수고 plasmid DNA 만을 분리하는 것이다. 이 때 중요한 것은 세균이 원래 가지고 있는 chromosomal DNA 와 plasmid DNA 를 구분하여 분리하는 것이다.

목차

없음

본문내용

1. introduction
Plasmid DNA 분리의 기본적인 원리는 세균의 cell wall 과 cell membrane 을 부수고 plasmid DNA 만을 분리하는 것이다. 이 때 중요한 것은 세균이 원래 가지고 있는 chromosomal DNA 와 plasmid DNA 를 구분하여 분리하는 것이다. 이 둘은 모두 DNA 이므로 성질이 비슷하기 때문에 구분하여 분리하기가 쉽지 않다. 다행히 chromosomal DNA 는 분리 과정에서 linear 형태이며 크기가 비교적 크기 때문에 이런 성질의 차이를 이용하면 분리할 수 있다. lysozyme은 달걀흰자와 눈물이나 타액과 같은 분비물에 존재하는 효소로 세포벽을 단단하게 하는 고분자 화합물을 절단시킨다. 반면에 EDTA는 세포벽의 integrity 를 유지하는 데 필수적인 calcium ion 을 제거하여 세포벽이 군데군데 무너지게 한다. 이 때 glucose는 삼투압을 유지시켜 세포의 외형을 유지시켜 준다. 이 과정에서 실험상 vortex를 해야 하는데 이 때 세포가 완전히 깨지게 되면 chromosomal DNA 가 잘게 깨지게 되어 plasmid DNA 와 구분할 수 없게 된다. 따라서 이렇게 세포를 유지시켜가면서 세포벽만 깨는 것이다. chromosomal DNA는 세포막에 결합된 상태로 남아있게 되고 원심분리로서 침전시켜 모을 수 있으며 plasmid DNA는 상등 액에서 isopropanol(Holmes and Quigley,1981)로 침전시켜 분리할 수 있다.
Alkali lysis method 의 핵심 원리
분리한 DNA의 전기영동사진
분리방법
① Alkaline lysis miniprep
alkaline lysis procedure(Bimboim, Doly, 1979)은 가장 일반적으로 쓰이는 분리방법이다. Plasmid DNA는 plasmid을 지니고 있는 bacteria에서 적은 양의 배양으로 분리될수 있다. Bacteria는 sodium dodecyle sulfate(SDS), NaOH를 함유하는 용액으로 처리하여 용균되어 진다(여기서 SDS는 bacterial proteins을 변성시키며 NaOH는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 변성시킨다). 다음 potassium acetate를 첨가하여 혼합액을 중성화시키는데 이것은 covalently closed plasmid DNA를 빠르게 reanneal 시킨다. chromosomal DNA와 bacterial proteins의 대부분은 침전되며(SDS는 potassium과 화합물을 이룬다) 침전물은 원심분리로서 제거할 수 있다. plasmid DNA는 상등액에 남아있게 되고 ethanol precipitation으로 집중시킬 수가 있다.

참고자료

· ESSENSTIALS of 유전학 월드사이언스 황혜진 외 4명