[세균학실험]2.세균의유전자재조합

소개

실험서입니다.

목차

1. Result
2. Description
3. Discussion
4. Reference

본문내용

2. Description

세균의 유전자 재조합 현상 중에서 형질전환을 통하여 우리가 원하는 유전자를 다량 확보할 수 있는 실험이었다. 형질전환은 제한효소 처리, Ligation, 세포에 넣어주어 형질전환 시키는 3가지 단계로 이루어진다.
먼저 PCR microcentrifuge tube 2개에 각각 한 개는 증류수 14μl와 공여세균 염색체 DNA 3μl를 넣고, 다른 한 개에는 증류수 14μl와 pUC19 3μl를 넣는다. 여기서 첫 번째 tube는 원하는 형질을 얻고자 하는 Insert로 작용하며, 두 번째 tube는 DNA를 삽입할 수 있는 플라스미드 vector로 작용한다. 각각의 tube에는 EcoRI 제한효소 2μl와 제한효소 buffer 3μl를 혼합시킨 용액 5μl를 넣어주는데 이 때 제한효소는 열에 약하기 때문에 얼음에 항시 보관해야한다. 처리된 tube는 37℃항온수조에서 1시간 동안 반응시켜 Insert와 vector를 같은 제한효소에 의해 같은 말단모양으로 절단시킨다.
다음으로 새로운 PCR microcentrifuge tube 2개에 각각 한 개는 증류수 5μl와 제한효소 처리된 Insert DNA 9μl를 넣어주고, 다른 한 개에는 증류수 5μl와 제한효소 처리된 vector 3μl를 넣는다. 그리고 ligation 시켜주는데 T4 ligase 1μl와 T4 ligase buffer 2μl를 넣고 혼합하여 실온에서 60분간 반응시켜 vector와 Insert가 붙을 수 있도록 한다.
Ligation 반응을 마친 DNA 10μl는 Competent cell(E.coli DH5a) 100μl를 넣은 E. tube에 넣어준 후 15분간 얼음에서 반응시킨다. 그 후 37℃ 항온수조에서 5분간 열처리하고 바로 얼음에 옮겨 10분간 식히는데, 이는 열처리를 주어 충격을 주면 세포막이 열려 플라스미드 vector가 Competent cell 안으로 들어가도록 하고 얼음에 식힘으로써 다시 세포막이 닫아 지게 하도록 하는 것이기 때문에 시간에 유의해야한다. E tube는 멸균된 LB broth 1000μl를 넣고, shaking incubator(200rpm,37℃,40분)에 배양시키고

참고자료

· 미생물학 / WIIWLLEY 지음 / 김영민 김경민 외 1명 옮김 / 라이프사이언스 펴냄 / 307~308
· 네이버 백과사전