DNA gel electrophoresis, Plasmid DNA isolation

소개

분리시킨 Plasmid DNA를 gel 전기영동을 통해 T-vector가 제대로 insert 되었는지 살펴보는 실험이었습니다.

●Sol Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 조성 및 역할
●DNA 추출방법 Alkaline lysis method
●Alkaline lysis method 의 핵심 원리
●Etbr (Ethidium Bromide)
●Gel loading buffer

위의 5가지에 대한 discussion이 있답니다.
많지는 않지만 실험 중간에 찍은 사진도 함께 넣었습니다.

목차

없음

본문내용

Material
실험복, 실험용 장갑, 튜브, 튜브꽂이, 피펫, LB broth, Sol Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ, 100% EtOH, 70% EtOH, PCI, loading buffer, D.W, FARAFILM, staning, destanin, centrifuge, vaccum dry,
Method
● Plasmid DNA isolation
1. colony를 배양시킨 LB broth를 1.5ml tube에 담는다.
2. centrifuge, 12000rpm, RT, 1min
3. 상층액을 버리고 solⅠ100μl를 넣는다.
4. Vortex, 2min
5. sol Ⅱ 200μl를 넣은 후 inverting 해준다. (약 7-10번)
6. sol Ⅲ 170μl을 넣은 후 inverting 해준다.
7. centrifuge, 12000rpm, 4℃, 5min
8. 상층액 + PCI 동량
9. centrifuge, 12000rpm, 4℃, 5min
10. 상층액 + 100 EtOH 1ml을 넣는다.
11. centrifuge, 12000rpm, 4℃, 15min
12. 상층액을 버린 후 70% EtOH 500μl을 넣는다.
13. centrifuge, 12000rpm, 4℃, 5min
14. vaccum dry, 약 7분
15. D.W 30μl 넣어준 후 tapping해준다.
16. loading
●DNA gel electrophoresis
1. PARAFILM에 loading buffer 를 떨어뜨린 후 그곳에 DNA 2μl을 떨어뜨린 후 piping 한다.
2. well에 잘 loading한다.
3. marker를 well에 2μl loading 한다.
4. 100V, 15min
5. staning 10min
6. destanin 10min
7. 사진을 찍어서 관찰한다.
Result
사진 ①
insert가 T-vector에 제대로 삽입이 되지 않았으며, 밑에 보이는 흰 부분은 RNA가 깨끗하게 제거 되지 않았음을 알려준다.
∴ T-vector가 3000bp, insert가 650bp = 3650bp에서의 base pair가 보이지 않는다.

참고자료

· http://kin.naver.com/detail/detail.php?d1id=11&dir_id=110205&docid=3288985&qb=ZG5hIOy2lOy2nCBzb2x1dGlvbg==&enc=utf8&pid=fVPjSdoi5URssaP9htwsss--337818&sid=SseXkPFmx0oAADuqLmI
· http://blog.naver.com/slgkje?Redirect=Log&logNo=150069847850
· http://www.genosapiens.com/wizboard.php?BID=info&mode=view&UID=26&CURRENT_PAGE=1&BOARD_NO=25&SEARCHTITLE=&searchkeyword=&category=