[면역학실험보고서]cell counting

소개

Mouse를 부검하여 임파 장기들을 관찰하고, Thymus cell의 viability 관찰 및 cell counting 실험 보고서. centrifuge의 종류 및 동작 원리 자료 포함.

목차

Ⅰ. 실험 보고서
1. 실험일시
2. 실험목표
3. 실험도구
4. 실험과정
4. 고찰


Ⅱ. Centrifuse의 종류 및 작동 원리
1. 원심분리기의 정의 
2. 원심분리기의 사용 
3. 원심분리의 원리
4. 원심분리기의 성능에 따른 분류
5. 원심분리기의 로터 (rotor)

본문내용

Ⅰ. 실험 보고서

1. 실험일시: 2010년 3월 29일(월) 1:00~16:00
2. 실험목표: Mouse를 부검하여 임파 장기들을 관찰하고, Thymus cell의 viability 관찰 및 cell counting을 진행 한다.
3. 실험도구: Mouse, 수술용 가위, Forcep, 알코올, 해부대, 고정용 핀, Micro pipette, Petri dish, Test Tubes, Slide glass, PBS 용액, Trypan blue 0.4% in BSS, Hemacytometer, microscope, hand counter, centrifuge


1. 실험목적: Thymus cell의 viability 관찰 및 cell counting

2. 실험원리 - Hemocytometer를 이용한 세포계수법
1) Hemocytometer에 Cover glass를 덮고 cell suspension을 피펫으로 취하여 hemocytometer의 V 모양 홈에 loading 한다. 모세관 현상에 의해 고루 퍼진다.
2) 현미경으로 관찰하연서 hand counter를 이용해 cell의 개수를 센다. Hemocytometer를 현미경 하에서 관찰하면 오른쪽 그림과 같은 grid를 볼 수 있다.
크게 9개의 square가 있으며, 각각의 square는 가로, 세로가 1mm인 정사각형으로 이루어져 있다. 가운데 사각형은 주로 적혈구를 세는데 이용하며 일반 세포를 셀 때에는 모서리의 4칸을 센 후 평균을 내어 이용한다.
3) 하나의 사각형의 부피는 10-4ml 이므로 (가로 1mm x 세로 1mm x cover glass를 덮었을 때의 높이 0.1mm = 0.1mm³= 10-4ml)  count한 cell 수의 계산은 sample 1ml당 한 칸에 든 평균 cell 수에 10⁴를 곱한 수만큼 cell이 있다고 생각할 수 있다. 예를 들어, count한 cell의 수가 25개인 경우, sample 1ml안에는 25 x 10⁴개 만큼의 cell이 있다고 계산하게 된다.
한 칸에 들어있는 cell 수가 50-100개면 적당한데 그 이상인 경우 정확도가 떨어지므로 sample을 더 희석하는 게 좋다. 이때에는 그 희석배수 만큼을 더 곱해준다.
4) live cell과 dead cell를 구분하기 위하여 trypan blue 를 처리한다.

3. 실험과정
1) single cell 만들기
① mouse 부검시에 절개하여 petri dish의 PBS(5㎖)에 넣어 둔 Thymus를 slide glass로 비벼서 single cell로 분리한다.
② 피펫으로 5㎖를 취해 test tube에 옮긴다.(찌꺼기는 옮겨지지 않도록 주의한다.)
2) cell washing
① test tube의 cell suspension을 centrifugation 한다.
※ Centrifugation시 주의사항
• 조건: 4℃, 1000rpm(184G), 5분
(원심분리시 열이 발생하면 세포에 damage가 생길 수 있으므로 4℃ 유지.)
• 무게 균형 주의할 것.
• 1000rpm(목표 rpm)에 도달시까지 자리를 지키고 원심분리기를 관찰한다.(이상 상황 발생시 기계 stop!)
② 상층액을 제거한 후 test tube의 아랫부분을 손가락 끝으로 튕겨서 풀어준후(PBS를 먼저 넣으면 잘 안풀림) fresh PBS 3ml를 넣는다.
☞ 여기까지가 1회 washing임. 보통 3회 washing을 실시하나 이번 실험에서는 1회만 washing 하기로함.
3) hemacytometer chamber에 옮기기
① 세포숫자가 너무 많으면 count가 힘들기 때문에 count를 용이하게 하기 위해 30배 희석하여 관찰하기로 하였다. cell suspension의 3ml 중에서 20ul를 취하여 580ul의 PBS와 혼합하여 총 600ul를 만들어준다. ⇒ 30배 희석
② living cell과 dead(또는 damaged) cell의 구분을 용이하게 하기 위하여 Trypan blue로 염색한다. 600ul의 cell suspension 중 30ul를 취하여 Trypan blue 30ul와 혼합한다. ⇒ 다시 2배 희석, 총 60배 희석 효과!
③ Micro pipette을 이용해서 Hemacytometer의 chamber와 cover glass 사이 공간으로 조심스럽게 넣는다. (모세관 현상으로 공간이 채워짐)
④ 현미경으로 cell의 viability를 관찰한 후 cell을 counting하고 thymus 전체의 세포개수를 계산한다.

참고자료

· 없음