생화학 실습 report

소개

한학기 동안 생화학 실험 report 총망라한 자료

목차

RNA extraction from tissue
1st stranded cDNA preparation by Oligo dT
cDNA synthesis
Detection of Gene Production by Polymerase Chain Reaction(PCR)
PCR loading

본문내용

RNA extraction from tissue
(All reagents are required as RNA grade)
1. tissue(~10mg) in 0.2ml of easy-BLUE(TRIZOL) (RNA추출하는 phenol시약) reagents
2. add 40ml of chloroform(물보다 무겁다), vortex vigorously for 1min
3. put the tube at Room Temperature for 5-10min
4. centrifuge at 12000rpm for 10 min at 4℃, sup
5. once of PCI extraction (same volume of PCI solution, vigorously vortex for 1min), centrifuge
*PCI: DEPC-TE saturated Phenol/Chloroform/Isoamylacohol(25/24/1의 비율)
Phenol/Chloroform/Isoamylacohol이 세포에서 단백질들을 화학적으로 변성시킨다. 자기들끼리 얽혀서 debris를 형성하여 원심 분리하면 가라앉게 된다.
6. take the sup, carefully (debris는 배제하고 좋은 sup만 뽑아낸다)
7. add 1/10 volume of 3M NaOAc (sodium acetate, 알콜에 의한 침전촉진, RNA•DNA의 수분을 알콜이 다 뺏어감) and same volume of 2-propanol(volume for the sup, 핵산을 침전시키는 역할)
8. mix thoroughly, and then store at Room Temperature for 5 min
9. centrifuge at 12000rpm for 10 min at 4, ppt (펠렛은 sodium과 RNA의 집합체인데 sodium은 핵산침전에만 필요하고 그 후에는 필요가 없다.)
10. rinse with 0.3-0.5ml of 75% ethanol, mix (위에 떠있는 물층을 버리고 에탄올을 넣어준다. 75%는 sodium만 골라 버릴 수 있는 적정농도이다. 나머지 25%는 멸균수가 더 중요한데, sodium만 빼내기 위해 멸균수가 필요하다. 물만100% 넣으면 RNA가 다 녹아버리기 때문에 75%로 맞추는 것이 중요하다.)
11. centrifuge at 12000 rpm for 10 min at 4℃
12. Remove the extra ethanol completely, ppt. Dray at Room Temperature for 3-5min (완전제거 하지 않으면 말리는 시간이 오래 걸린다. 알코올이 날아가고 물이 남으면 RNA가 녹게 되기 때문에 완전히 말려야 한다.)

참고자료

· 없음