compedent cell의 제조 실험 노트

소개

compedent cell의 제조 실험 노트
실험목적, 실험방법, 주의사항 및 토의

목차

Competent cell의 제조
실험목적
실험재료
실험방법
주의사항 및 고찰

본문내용

실험목적
Competent cell을 제조하여 DNA가 잘 들어 갈 수 있는 cell을 만들어 DNA Transformation의 성공률을 높인다.
실험재료
LB 배지, 박테리아 균주 (DH5 alpha), 0.1M의 filtered CaCl2 용액
0.5mL eppendorf tube, conical tube, 37℃, Shaking incubator
Vortex Mixer, deep freezer, micropipette, flask
실험 방법
E. Coli 등의 대부분의 박테리아는 일반적 환경에서 제한 된 양의 DNA만을 받아들이다. 정상적인 박테리아에 화화적, 물리적 처리를 하여 DNA를 받아들이는 능력을 임의적으로 향상시킨 cell을 Competent cell 이라고 한다. 화학처리에 쓰이는 시약은 다음과 같이 여러 가지가 있으며 이 중 가장 일반적인 것은 calcium chloride이다.
- Calcium chloride
- Manganase chloride
- Hexaumminecobalt chloride
- Dimethyl Sulfoxide(DMSO)
* Calcium chloride를 이용한 Competent cell의 제조 방법
1. LB plate에 자란 박테리아(DH5 alpha colony)를 멸균된 팁이나 이쑤시개에 묻힌 후 LB 배지 2ML이 담긴 시험관에 넣고 37℃, Shaking incubator에서 12~18시간 배양한다.
2. 1의 박테리아 배양액 1ml을 100ml LB배지가 담긴 플라스크에 넣고 O.D.600에서 0.4가 될 때까지


주의 사항 및 토의
실험에 사용되는 팁, 이쑤시개, 플라스크, LB배지, eppendorf tube, conical tube는 목적하는 균만 배양하기 위해서 반드시 120℃ 이상의 고온, 고압의 조건에서 멸균하여 사용해야한다. 원심분리 후 튜브 밑에 가라앉은 cell이 다시 부유 되지 않도록, 상등액을 버릴 때 주의해야 하며, 상등액을 버리고, 0.1M의 filtered CaCl2 용액을 넣은 후 cell이 충분히 부유되게 하기 위해 골고루 vortex해줘야 한다. vortex를 잘 해줘야 박테리아 농도가 일정한 compedent cell을 만들 수 있다. 또한 박테리아와 같은 생물체를 다루는 실험이므로 빠르게 진행해야 효과 좋은 Competent cell을 만들 수 있다. 상온에서 오래 노출 된 cell은 활성이 떨어져 건강하지 못한 박테리아가 되기 때문이다. 그러므로

참고자료

· 분자생물학 Robert F. Weaver/ 박상대 역/ 라이프사이언스