[A+] 2024 서강대 현대생물학실험1 2차 (His tagged eGFP 단백질의 발현 및 정제)

소개

"[A+] 2024 서강대 현대생물학실험1 2차 (His tagged eGFP 단백질의 발현 및 정제)"에 대한 내용입니다.

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Materials & Methods
4. Results
5. Discussion
6. References

본문내용

이번 실험은 원하는 목적 단백질을 E.coli system에서 과발현시키고 정제하여 목적 단백질을 얻고 그 단백질을 확인하여 얻은 단백질의 농도를 정량하기 위함이다. 이번 실험에서의 목적 단백질은 eGFP로 6x His sequence를 포함하는 pET28a(+) vector에 eGFP 유전자를 cloning하였고 T7 RNA polymerase 유전자를 갖는 BL21(DE3) E.coli에 transformation하고 IPTG를 처리해 6x His tagged eGFP를 과발현시켰다. Sonication을 통해 세포를 파괴하여 protein mixture를 얻고 His tag와 니켈 이온 간의 친화성을 이용하는 affinity chromatography를 통해 eGFP를 정제했다. Ultrafiltration으로 eGFP sample을 농축하고 SDS-PAGE와 Coomassie blue staining을 통해 eGFP의 정상적인 과발현과 정제를 확인하였다. Extinction coefficient assay에서 280nm, 488nm에서의 흡광도를 이용해 정량한 단백질의 농도는 전체 eGFP 0.1827mM, functional eGFP 0.1268mM로 functional eGFP의 비율은 69.40%로 계산되었다. BSA standard curve를 그리고 750nm에서의 흡광도를 이용해 단백질을 정량한 Lowry assay에서는 eGFP 농도가 6.08mg/ml로 계산되었다. 이는 extinction coefficient assay를 통해 구한 3.59mg/ml(0.1268mM)보다 훨씬 큰 값으로 이는 Lowry assay가 아미노산 조성에 의해 영향을 받기 때문이다.

참고자료

· Yingying Ma, Jian Guo Yu (2015), The mechanism of dehydration in chromophore maturation of wild-type green fluorescent protein : A theoretical study, Chemical Physics Letters, pp. 42~46Shelley R. McRae, Christopher L. Brown (2005), Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity, Protein Expression and Purification, 41(1): 121~127
· David L. Nelson (2021), Lehninger Principles of Biochemistry, 8th, W.H. Freeman and Company, pp. 86~88
· Everette J. D., Quinton M. Bryant (2010), Thorough Study of Reactivity of Various Compound Classes toward the Folin-Ciocalteu Reagent, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58(14): 8139~8144