Protein electro-transfer and Western blot 실험보고서

문서 내 토픽

• 1. Western blot

  Western blot은 찾고자 하는 protein의 antigen epitope와 반응하는 antibody를 이용하여 단백질 혼합물 중에서 원하는 단백질(antigen)을 찾아내는 방법이다. 전기 영동을 이용하여 단백질을 gel 상에서 크기에 따라 분리한 후, membrane에 transfer한다. Membrane에 발광하는 probe가 붙어 있는 antibody를 붙여주는 항원-항체 반응을 이용하여 찾고자 하는 특정 단백질을 검출한다.

• 2. Nitrocellulose membrane

  Nitrocellulose membrane은 다른 membrane들에 비해 질기고 단단하며 protein이 잘 흡착되는 특성이 있어 Western blot에 보편적으로 사용된다. Nitrocellulose membrane의 protein binding capacity는 80-100ug/cm2이다. Protein은 nitrocellulose membrane에 hydrophobic interaction을 통해 binding한다.

• 3. PVDF membrane

  PVDF membrane의 protein binding capacity는 170-200ug/cm2이다. PVDF가 nitrocellulose membrane보다 높은 protein binding capacity를 가지고 있기 때문에, sensitivity가 높다. 따라서 더 적게 발현되는 protein도 detect할 수 있다는 장점이 있지만, antibody detection 과정에 있어서 back ground noise 더 높다는 단점이 있다.

• 4. Transfer buffer 조성

  Transfer buffer의 조성은 Tris-base, Glycine, 20% methanol이다. Methanol이 들어가는 이유는 polyacrylamide gel에서 protein이 잘 빠져나오도록 도와주고, SDS-PAGE 시에 detergent로 사용되어 protein에 binding됬던 SDS가 protein에서 떨어지도록 하며, nitrocellulose membrane에서 hydrophobic interaction에 의해 protein immobilization이 발생할 때 higher molecular weights을 가지는 protein도 membrane에 잘 immobilization되도록 한다.

• 5. BSA와 skim milk의 차이

  BSA는 60kDa의 single type의 purified protein만으로 구성되지만, skim milk는 다양한 크기를 가지는 많은 mixed protein으로 구성된다. 따라서 skim milk가 BSA에 비해 antibody의 non-specific binding을 더 효과적으로 막아주며, false positive 확률이 낮다. Strong binding하는 antibody를 사용하는 경우 skim milk를 사용하고, Weak binding하는 antibody를 사용하거나 target protein이 적은 경우 BSA를 주로 사용한다.

• 6. 항체

  항체는 immune system에서 antigen (pathogenic bacteria나 virus)과 특이적 결합을 하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질이다. 기본 구조는 Y-shaped의 protein이며, heavy chain에 disulfide bond로 붙어있는 light chain으로 구성되는 immunoglobin superfamily에 속하는 glycoprotein이다. 치료용 항체는 의약품 중에서 가장 빠른 성장을 보이고 있으며, 암, 자가면역질환, 이식거부반응, 감염증, 심장병 등의 치료에 FDA의 승인을 받았다.

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• 1. Western blot

  Western blot은 단백질 분석을 위한 강력한 기술로, 특정 단백질의 존재와 상대적인 양을 확인할 수 있습니다. 이 기술은 세포 내 단백질 발현 수준, 단백질 변형, 단백질 상호작용 등을 연구하는 데 널리 사용됩니다. Western blot은 시료 준비, 전기영동, 단백질 전이, 항체 반응, 신호 검출 등 여러 단계로 구성되며, 각 단계에서 최적화된 조건이 필요합니다. 특히 항체 선택과 반응 조건은 실험 결과에 큰 영향을 미치므로 주의 깊게 설계해야 합니다. Western blot은 정성적 분석에 유용하지만, 정량적 분석을 위해서는 추가적인 기술이 필요합니다. 전반적으로 Western blot은 단백질 연구에 필수적인 기술이며, 지속적인 기술 발전과 함께 다양한 응용 분야에서 활용될 것으로 기대됩니다.

• 2. Nitrocellulose membrane

  Nitrocellulose membrane은 Western blot에서 단백질을 고정하는 데 널리 사용되는 막 재료입니다. 이 막은 단백질과 강한 비공유 결합을 형성하여 단백질을 효과적으로 고정할 수 있습니다. 또한 nitrocellulose membrane은 항체와 잘 결합하여 항체 반응을 용이하게 합니다. 그러나 nitrocellulose membrane은 수분에 약하고 취급이 까다로운 단점이 있습니다. 이를 보완하기 위해 PVDF 막이 개발되었지만, nitrocellulose membrane은 여전히 Western blot에서 가장 널리 사용되는 막 재료 중 하나입니다. 최근에는 nitrocellulose membrane의 특성을 개선한 새로운 막 재료들도 등장하고 있어, Western blot 기술의 발전에 기여할 것으로 기대됩니다.

• 3. PVDF membrane

  PVDF (polyvinylidene fluoride) membrane은 nitrocellulose membrane의 단점을 보완하기 위해 개발된 막 재료입니다. PVDF membrane은 nitrocellulose membrane에 비해 기계적 강도가 높고 수분에 강하며, 단백질 고정력도 우수합니다. 또한 PVDF membrane은 항체 반응에도 적합하여 Western blot 실험에 널리 사용됩니다. PVDF membrane은 특히 단백질 분석이 까다로운 경우, 예를 들어 소수성 단백질이나 저발현 단백질을 분석할 때 유용합니다. 그러나 PVDF membrane은 nitrocellulose membrane에 비해 비용이 높은 편이며, 일부 단백질에 대해서는 결합력이 낮을 수 있습니다. 따라서 실험 목적과 단백질 특성에 따라 적절한 막 재료를 선택하는 것이 중요합니다.

• 4. Transfer buffer 조성

  Western blot에서 단백질을 막으로 효과적으로 전이시키기 위해서는 적절한 transfer buffer 조성이 중요합니다. Transfer buffer는 일반적으로 Tris, glycine, methanol로 구성되며, 이 성분들은 각각 다음과 같은 역할을 합니다. Tris는 완충 작용을 하여 pH를 적절하게 유지하고, glycine은 단백질의 이동을 촉진하며, methanol은 단백질의 고정을 돕습니다. 이 외에도 SDS나 DTT 등의 첨가제를 사용하여 단백질 전이 효율을 높일 수 있습니다. Transfer buffer 조성은 사용하는 막 재료, 단백질 특성, 전기영동 조건 등에 따라 최적화되어야 합니다. 예를 들어 PVDF membrane의 경우 methanol 농도를 높이는 것이 효과적일 수 있습니다. 또한 저분자량 단백질과 고분자량 단백질의 전이 효율이 다를 수 있어, 이를 고려한 buffer 조성이 필요합니다. 따라서 Western blot 실험에서는 transfer buffer 조성을 실험 조건에 맞게 최적화하는 것이 중요합니다.

• 5. BSA와 skim milk의 차이

  Western blot에서 비특이적 결합을 차단하기 위해 사용되는 BSA(Bovine Serum Albumin)와 skim milk는 각각 장단점이 있습니다. BSA는 순수한 단백질 성분으로, 비특이적 결합을 효과적으로 차단할 수 있습니다. BSA는 단백질 구조가 잘 알려져 있어 실험 결과의 재현성이 높고, 단백질 농도를 정확히 조절할 수 있습니다. 또한 BSA는 단백질 분해효소에 의해 분해되지 않아 실험 중 안정적으로 유지됩니다. 반면 skim milk는 다양한 단백질 성분을 포함하고 있어, 비특이적 결합 차단 효과가 BSA보다 다소 낮을 수 있습니다. 그러나 skim milk는 BSA에 비해 상대적으로 저렴하고 구하기 쉬운 장점이 있습니다. 또한 skim milk에는 casein 등의 단백질이 포함되어 있어, 항체와의 비특이적 결합을 효과적으로 차단할 수 있습니다. 따라서 실험 목적과 예산, 실험 대상 단백질의 특성 등을 고려하여 BSA와 skim milk 중 적절한 차단제를 선택하는 것이 중요합니다. 때로는 두 차단제를 병행하여 사용하는 것도 효과적일 수 있습니다.

• 6. 항체

  Western blot에서 항체는 단백질 검출의 핵심 요소입니다. 항체의 특이성과 감도에 따라 실험 결과의 정확성이 크게 달라질 수 있습니다. 항체 선택 시 고려해야 할 사항은 다음과 같습니다. 첫째, 타겟 단백질에 대한 특이성이 높은 항체를 선택해야 합니다. 비특이적 결합을 최소화하기 위해 단일클론 항체를 사용하는 것이 좋습니다. 둘째, 항체의 감도가 충분히 높아야 합니다. 저발현 단백질을 검출하려면 고감도 항체가 필요합니다. 셋째, 항체의 반응 조건을 최적화해야 합니다. 항체 농도, 반응 시간, 완충액 조성 등을 실험적으로 확인하여 최적의 조건을 찾아야 합니다. 이 외에도 항체의 종류(예: 일차 항체, 이차 항체), 표지 방식(예: HRP, fluorescent), 보관 조건 등도 실험 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 Western blot에서는 실험 목적과 단백질 특성에 맞는 항체를 선택하고, 항체 반응 조건을 최적화하는 것이 매우 중요합니다.