이화여대 생명과학실험 A+ 리포트(RNA inteference를 사용한 유전자 억제 발현 시험)

문서 내 토픽

1. Transformation

Transformation은 분자생물학적 현상으로 박테리아 사이에서 외래 DNA 분자를 수평으로 전달하여 세포에 도입시켜 유전자가 재조합되는 현상이다. 실험실에서는 외부 DNA segment를 세포에 삽입하여 원하는 타겟 형질을 발현시키는 방법으로 사용하며, 최근에는 비세균성 세포인 animal/plant cell에 새로운 유전자를 삽입하는 경우까지 포함한다. 형질전환은 자연 상태에서도 일어나고 실험실에서도 유도할 수 있는데, 자연계에서는 starvation이나 cell density와 같은 조건에서 일어날 수 있다. 박테리아 간의 DNA 이동, 즉 형질전환이 일어나기 위해서는 competent cell 형태가 되어야 한다. 실험실에서는 외래 DNA와 DNA를 수용할 박테리아가 둘 다 음전하를 띠기 때문에 전기적인 극성으로 서로 반발을 일으키기 때문에 쉽지 않다. 따라서 plasmid를 수용할 박테리아에 heat shock를 주어서 박테리아의 membrane potential을 감소하고 thermal balance가 무너뜨려 plasmid가 잘 삽입될 수 있도록 한다.
2. RNA interference

RNA interference는 RNA가 서열이 상보적인 타겟 mRNA에 결합하여 유전자 발현을 억제하는 현상을 의미한다. 유전자 발현의 억제는 RNA가 서열이 상보적인 타겟에 완벽하게 결합했을 경우에는 mRNA를 분해시키고, 일부 mRNA 서열에 결합했을 경우에는 번역과정을 억제하여 유전자 발현을 억제하는 기작이다. RNA 간섭은 긴 이중가닥 RNA가 Dicer에 의해 약 20여개 nucleotide 크기의 작은 siRNA로 만들어지고, 이중 가닥의 siRNA는 2개의 단일 가닥 RNA (ssRNA)로 풀릴 수 있는데 그 중에서 타겟 mRNA와 상보적인 결합을 할 수 있는 RNA를 guide RNA라고 하며, 이 가이드 RNA는 RISC에 결합한다. 가이드RNA가 타겟 mRNA와 상보적으로 결합을 하면 RISC에 존재하는 아고너트2가 mRNA를 분해를 시작한다.
3. Ca2+ transfection

Transfection은 정제된 바이러스의 핵산 혹은 플라스미드를 진핵세포에 도입하는 것을 말한다. 핵산을 도입시킬 때는 핵산을 수용하는 세포의 세포막과 핵산 둘 다 전기적으로 음전하를 띠기 때문에 반발력이 생겨서 도입시키기 쉽지 않다. 화학적인 방법 중 가장 쉽게 사용하는 방법 중 하나는 calcium phosphate를 사용하는 것이다. Transformation할 DNA가 함유되어 있는 염화칼슘 용액과 인산 이온을 함유한 염수용액을 섞으면 음전하를 띠는 DNA에 양전하인 칼슘이 붙어서 침전물이 형성된다. DNA와 칼슘의 침전물은 DNA와 진핵세포의 세포막의 전기적 반발력을 줄여주고, 이후 endocytosis에 의해 DNA가 세포 내부로 들어간다.
4. Transformation 실험 결과 분석

Transformation이 잘 이루어졌는지 확인하기 위해 ampicillin이 포함된 plate에서 하얀색 E.coli 콜로니가 잘 형성된 것을 확인하였다. Ampicillin이 포함되지 않은 plate를 사용했다면 형질전환에 성공한 세포와 실패한 세포가 모두 살아남아 있어 형질전환 성공 여부를 알 수 없었을 것이다. Ampicillin 저항성 유전자가 들어있는 selection marker를 사용하여 형질전환을 한 경우, ampicillin이 포함된 plate에서 ampicillin에 대한 저항성이 있는 세포만 살아남을 수 있기 때문에 형질전환에 성공한 세포를 확인할 수 있다.
5. RNA interference 실험 결과 분석

Transfection efficiency는 {(전체 cell 수 - GFP 발현 cell 수) / 전체 cell 수} * 100 = 91.7197452%로 계산되었다. GFP가 발현되는 세포가 존재하는 이유는 transfection 단계 혹은 그 이후에 RNA interference가 제대로 일어나지 못해 H2AX 발현이 억제되지 못했기 때문이다. 만약 transfection과 siRNA에 의한 RNA interference가 잘 되었다면 H2AX 발현이 억제되어 GFP가 발현되지 않았을 것이다.

Easy AI와 토픽 톺아보기

1. Transformation

Transformation is a fundamental process in molecular biology and genetics, where genetic material is introduced into a cell, allowing the cell to express new genetic traits. This process is widely used in various applications, such as genetic engineering, gene therapy, and biotechnology. The ability to transform cells has enabled researchers to study gene function, develop new therapeutic approaches, and produce valuable biomolecules. Understanding the mechanisms and factors that influence transformation efficiency is crucial for advancing these fields and unlocking new possibilities in science and medicine.
2. RNA interference

RNA interference (RNAi) is a powerful gene silencing mechanism that has revolutionized our understanding of gene regulation and opened up new avenues for therapeutic development. By using small interfering RNA (siRNA) or short hairpin RNA (shRNA) to target and degrade specific mRNA molecules, RNAi allows for the selective knockdown of gene expression, providing a valuable tool for studying gene function and developing targeted therapies. The potential applications of RNAi span a wide range of fields, from basic research to the treatment of genetic disorders, viral infections, and cancer. As our understanding of the RNAi pathway continues to grow, the development of more efficient and specific RNAi-based technologies will undoubtedly lead to groundbreaking advancements in the life sciences.
3. Ca2+ transfection

Ca2+ transfection is a widely used method for introducing genetic material into cells, particularly in the context of gene expression studies and cell line development. By utilizing the ability of calcium ions to facilitate the uptake of DNA into cells, this technique offers a simple and cost-effective approach to transfection. The efficiency of Ca2+ transfection can be influenced by various factors, such as the cell type, the DNA construct, and the transfection conditions. Optimizing these parameters is crucial for achieving successful gene delivery and expression. As a versatile and accessible transfection method, Ca2+ transfection continues to be a valuable tool in molecular biology and biotechnology, enabling researchers to explore gene function, develop cell-based models, and advance our understanding of cellular processes.
4. RNA interference experiment results analysis

The analysis of RNA interference (RNAi) experiment results is crucial for understanding the effectiveness and specificity of gene silencing. By carefully examining the outcomes of RNAi experiments, researchers can evaluate the degree of target gene knockdown, assess the impact on cellular processes and phenotypes, and identify potential off-target effects. This analysis may involve quantifying the reduction in target mRNA or protein levels, observing changes in cellular behavior or morphology, and comparing the results to appropriate controls. The interpretation of these findings can guide the optimization of RNAi reagents and delivery methods, inform the design of future experiments, and contribute to the development of RNAi-based therapeutic strategies. A thorough and rigorous analysis of RNAi experiment results is essential for drawing meaningful conclusions, validating the specificity of the gene silencing, and advancing our understanding of gene function and regulation.