HEK293T 세포 계대배양 및 핵산 추출 실험

본 내용은 " [충남대] 세포생리학실험 - HEK293T cell 계대배양과 genomic DNA 및 total RNA 추출 " 의 원문 자료에서 일부 인용된 것입니다. 2023.12.08

문서 내 토픽

• 1. HEK293T 세포 계대배양

  HEK293T 세포는 SV40 T 항원을 발현하는 형질전환 세포로, 높은 단백질 발현을 유도한다. 계대배양은 trypsin-EDTA를 이용하여 세포를 배양용기에서 분리하고, centrifuge로 세포를 수집한 후 새로운 배지에 옮기는 과정이다. 세포는 부착단백질과 결합할 때 길게 늘어난 형태를 보이다가, trypsin 처리 후 구형으로 변한다. 8일간의 배양 관찰 결과 시간이 지날수록 배지에 세포가 증식하여 빈 공간이 감소하는 것을 확인할 수 있다.

• 2. Genomic DNA 추출

  Genomic DNA 추출은 세포 용해, 단백질과 RNA 제거, DNA 추출, 순도 측정의 4단계를 거친다. 실험에서는 gDNA extraction buffer와 proteinase K를 이용하여 단백질을 분해하고, phenol-chloroform 추출법으로 불순물을 제거한 후 에탄올 침전법으로 DNA를 분리한다. 추출된 genomic DNA는 크기가 커서 전기영동 시 DNA marker보다 위쪽에 위치하며, 불순물 혼입 정도에 따라 band의 선명도가 달라진다.

• 3. Total RNA 추출

  Total RNA 추출은 세포 분쇄, 단백질 분해 제거, RNA 농축 및 검정 과정을 거친다. TRIzol 시약을 이용하여 RNA를 분리하고, chloroform 첨가로 유기층과 수용층을 분리한 후 isopropanol 침전법으로 RNA를 회수한다. 추출된 total RNA는 전기영동 시 크기별로 28S, 18S, 5.8S, 5S rRNA의 3개 band로 분리되며, RNase 오염으로 인한 RNA 분해를 방지하기 위해 DEPC 처리된 용액을 사용한다.

• 4. 세포배양 조건 및 pH 조절

  세포배양의 필수 조건은 무균 환경, 항생제, 온도(36~37℃), pH(7.2~7.4)이다. 배지의 pH는 세포 호흡으로 생성된 이산화탄소가 물에 녹아 탄산이 되고 수소 이온을 방출하면서 산성화된다. 이를 조절하기 위해 배지에 포함된 중탄산 이온이 수소 이온과 반응하여 pH를 유지하며, Incubator의 5% CO2 농도 유지도 pH 조절에 중요한 역할을 한다.

Easy AI와 토픽 톺아보기

• 1. HEK293T 세포 계대배양

  HEK293T 세포는 인간 배아 신장 세포주로서 생명공학 연구에서 매우 중요한 모델 세포입니다. 계대배양 시 세포의 생존율과 유전적 안정성을 유지하는 것이 핵심입니다. 적절한 배양 밀도 관리, 정기적인 배지 교환, 그리고 오염 방지가 필수적입니다. 계대 횟수가 증가할수록 세포의 특성이 변할 수 있으므로, 초기 계대수를 기록하고 관리하는 것이 중요합니다. 또한 세포 생존율 모니터링을 위해 Trypan blue 염색 등의 방법을 정기적으로 사용하여 배양 품질을 유지해야 합니다.

• 2. Genomic DNA 추출

  Genomic DNA 추출은 분자생물학 연구의 기초가 되는 중요한 기술입니다. 세포 용해, 단백질 제거, DNA 침전 등의 단계를 거쳐 고순도의 DNA를 얻을 수 있습니다. 추출 과정에서 RNase 처리, 페놀-클로로포름 추출, 또는 상용 키트 사용 등 다양한 방법이 있으며, 각 방법의 장단점을 고려하여 선택해야 합니다. DNA의 순도와 농도는 분광광도계로 측정하여 확인하고, 적절한 온도에서 보관하여 분해를 방지하는 것이 필수적입니다.

• 3. Total RNA 추출

  Total RNA 추출은 유전자 발현 연구에 필수적인 기술로, 세포의 생리적 상태를 반영하는 중요한 정보를 제공합니다. RNase 오염을 최소화하기 위해 멸균된 도구와 RNase-free 용액을 사용해야 하며, Trizol이나 상용 RNA 추출 키트를 활용할 수 있습니다. 추출된 RNA의 품질은 Agarose gel 전기영동이나 Bioanalyzer를 통해 확인하고, RNA의 무결성을 나타내는 RIN 값을 평가해야 합니다. 저온 보관과 적절한 보존제 사용으로 RNA 분해를 방지하는 것이 중요합니다.

• 4. 세포배양 조건 및 pH 조절

  세포배양의 성공은 최적의 배양 조건 유지에 달려 있습니다. 온도는 일반적으로 37°C, CO2 농도는 5%로 유지하여 pH를 7.2-7.4 범위에서 안정적으로 조절합니다. 배지의 pH는 세포 대사와 성장에 직접적인 영향을 미치므로, 정기적인 모니터링이 필수적입니다. 페놀레드 지시약을 포함한 배지를 사용하면 시각적으로 pH 변화를 감지할 수 있습니다. 또한 적절한 습도 유지, 배지 성분의 신선도 확인, 그리고 배양기의 정기적인 점검을 통해 일관된 배양 환경을 제공해야 합니다.