소개글
"Gene cloning"에 대한 내용입니다.
목차
1. 유전자 클로닝
1.1. 유전자 클로닝의 개요
1.2. 유전자 증폭과 전기영동
1.3. 벡터와 제한효소
1.4. DNA 연결효소와 형질전환
1.5. 플라스미드 추출과 분석
1.6. 실험 목적 및 주요 과정
2. 실험 재료 및 방법
2.1. Target gene PCR and DNA purification
2.2. 1% Agarose gel 제작
2.3. 제한효소 처리
2.4. DNA 연결반응 (Ligation)
2.5. 대장균 형질전환
2.6. 플라스미드 추출 (Mini prep)
2.7. 제한효소 처리 및 전기영동
3. 실험 결과
3.1. Target gene PCR 확인
3.2. 제한효소 처리 결과
3.3. 플라스미드 추출 및 분석
4. 고찰
4.1. 실험 과정 분석
4.2. 실험 결과에 대한 고찰
4.3. 개선점 및 추가 실험 제안
5. 참고 문헌
본문내용
1. 유전자 클로닝
1.1. 유전자 클로닝의 개요
유전자 클로닝이란 생물체의 특정 유전자를 세포에서 추출한 후, 그 유전자를 벡터 DNA에 삽입하고 Competent Cell에서 증식시킴으로써 균일한 유전자 집단을 생성하는 기술이다. 다른 말로 유전자 클론화라고도 하며 특정 유전자의 대량 복제를 위해 쓰이는 중요한 DNA 재조합 기술이다. 이 기술은 기본적으로 수많은 종의 유전체와 종간 유전적 다양성을 연구하기 위해서 유전체의 DNA 조각, 혹은 서로 겹쳐져 있는 염기서열의 분석을 위해 활용된다. 또한 개별 유전자 수준에서 핵산의 탐침(probe)을 생산하는데 이용된다. 핵산의 탐침은 어떤 유전자가 어디에 얼마나 어떻게 발현되는지를 알아내기 위한 주요한 수단이 되는데 이의 제작에 활용될 수 있다. 일반적으로 분자생물학과 세포생물학 연구 분야에서 각 유전자의 다양한 생물학적 기능과 중요성을 이해하기 위한 여러 조작을 위해 관심 유전자를 확보하는 것은 기초적으로 매우 중요하다. 또한 Gene cloning을 이용하여 재조합 단백질을 생산할 수 있어 실제로 생체에서 어떤 단백질의 결핍으로 인해 질환이 유발되는 경우, 치료 단백질 대량 합성을 위한 기술로 활용된다.
1.2. 유전자 증폭과 전기영동
PCR은 중합효소 연쇄반응으로 특정한 DNA의 염기 서열을 증폭하는 기법이다. 이 반응은 변성, 결합, 신장의 3단계로 이루어지며, 온도에 의해 DNA가 변성되는 것을 이용한 방법이다. PCR을 통해 특정 유전자를 대량으로 얻을 수 있으며, 이렇게 증폭된 DNA 조각은 전기영동을 통해 그 크기와 양을 확인할 수 있다.
전기영동은 DNA가 전류에 의해 이동할 수 있다는 것을 이용한 방법이다. DNA는 구조상 음전하를 띄므로 전류에 의해 이동할 수 있다. 전기영동을 통해 DNA 조각의 크기에 따른 이동 속도 차이를 확인할 수 있다. 이를 통해 이전 PCR 과정이 잘 진행되었는지 판별할 수 있다. 전기영동을 진행한 결과로 얻은 밴드에서 DNA를 다시 추출하기 위해 잘라내는 과정을 gel extraction이라 하고, 순수한 DNA를 얻기 위해 washing 과정을 통해 정제하는 것을 purification이라고 한다.
따라서 유전자 클로닝에서 유전자 증폭과 전기영동 단계는 매우 중요하다. PCR을 통해 목적 유전자를 대량으로 증폭하고 전기영동을 통해 그 결과를 확인하여 순수한 유전자를 분리하는 것은 유전자 클로닝의 핵심 과정이라고 할 수 있다.
1.3. 벡터와 제한효소
벡터는 유전자 클로닝을 위해 사용되는 DNA 분자로, 세포 내에서 자가 복제할 수 있는 능력을 가지고 있다. 벡터에는 숙주 세포에서 증폭되게 하는 origin of replication과 선별을 위한 마커 유전자 등이 포함되어 있다. 주로 사용되는 벡터에는 플라스미드, 박테리오파지, 인공 염색체 등이 있다.
플라스미드는 세균 세포 내에 존재하는 작은 원형의 이중나선 DNA로, 유전공학 실험에서 가장 널리 사용되는 벡터이다. 플라스미드는 숙주 세포의 염색체와 독립적으로 복제될 수 있으며, 작은 크기와 다수 복제 등의 장점이 있다. 또한 플라스미드에는 항생제 저항성 유전자나 선별 마커가 포함되어 있어 세포 내 도입된 플라스미드를 손쉽게 확인할 수 있다.
제한효소는 특정한 염기서열을 인식하여 DNA를 자르는 효소로, 유전자 재조합 기술에서 매우 중요한 역할을 한다. 제한효소는 박테리아와 고세균에서 유래되며, 현재 수많은 종류의 제한효소가 발견되어 활용되고 있다. 제한효소는 DNA 내 특정 염기서열을 인식하여 이중가닥 DNA를 자르는데, 이때 절단 부위의 말단이 점착성 말단(sticky end)이 되거나 평활 말단(blunt end)이 된다. 점착성 말단은 DNA 단편 사이의 연결에 유리하게 작용하여 DNA 조각을 연결하는 데 사용된다.
플라스미드와 제한효소는 유전자 클로닝에서 핵심적인 역할을 한다. 먼저 플라스미드는 타 유전자를 삽입할 수 있는 장소를 제공하고, 삽입된 플라스미드는 숙주 세포에서 증폭되어 다량의 유전자를 생산할 수 있게 한다. 제한효소는 플라스미드와 삽입하고자 하는 타 유전자를 적절한 위치에서 절단하여 DNA 단편을 생산하는데 사용된다. 이렇게 준비된 플라스미드와 유전자 단편은 DNA 연결효소를 통해 결합되어 재조합 DNA를 형성하게 된다.
따라서 벡터인 플라스미드와 제한효소는 유전자 클로닝 기술의 핵심적인 구성요소이며, 이들의 활용을 통해 다양한 유전자를 효율적으로 증폭하고 조작할 수 있다고 할 수 있다.
1.4. DNA 연결효소와 형질전환
DNA 연결효소는 세포에서 가장 중요한 효소 중 하나이다. 이 효소는 DNA 복제, 재조합, 수선 과정을 포함하는 수많은 세포내 과정뿐만 아니라 DNA 이중나선의 틈을 연결하거나 부서진 DNA 나선을 결합할 필요가 있을 때마다 필수적으로 사용된다.
재조합 DNA 기술에서 DNA 연결효소의 중요한 기능은 이중나선 DNA 단편들을 연결하여 손상되지 않은 온전한 분자로 만드는 것이다. 연결효소는 DNA 단편의 3'-OH-5'인산 말단 사이에 인산다이에스터 결합을 형성한다. 이 반응은 여러 단계를 통해 이루어지는데, 활성 부위 라이신의 아데닐화는 파지와 진핵생물에서는 ATP를 이용하고, 박테리아에서는 NAD+를 이용한다.
재조합 DNA 기술의 목적을 위해, 점착성 DNA 말단을 연결시키는 연결효소와 비점착성 DNA를 연결하는 연결효소를 구별해야한다. 상보적인 돌출부의 염기쌍을 통해 가까이에 위치하게 되는 DNA 단편들의 인산다이에스터 골격을 연결하는 것이 역학적으로 더 쉽기 때문에 첫 번째 유형의 연결효소가 대부분 이용된다. DNA Ligase가 그 대표적인 예이다. 비점착성 말단을 연결하는 것이 훨씬 어려워 그 효율이 많이 떨어진다.
한편, 세균은 세균 밖에 존재하는 DNA를 자기 스스로 세포 안으로 끌어 들여서 자신의 형질을 변화시키는 성질들이 있다. 이런 형질의 변화를 형질전환(Transformation)이라 하며 폐렴균, 고초균 등에서 관찰된다. 이들 세균은 자연적으로 형질전환을 일으킬 수 있으나 모든 세균들이 DNA 도입에 있어서 동일한 효과를 보이지 않는다. 대장균은 자연적으로 형질전환을 할 수 없어서 인위적으로 염화칼슘 처리를 해야만 세포 밖의 DNA가 세포 안으로 확산되어 들어갈 수 있다. 이처럼 세균에 물리적 또는 화학적 처리를 하여 세균이 DNA를 받아들일 수 있게 처리되었을 때 이를 수용성(competent)이라 하고, 이러한 세포를 competent cell 이라고 한다.
본 실험에서는 인위적으로 competence를 높인 competent cell에 recombinant DNA가 원활하게 주입되도록 heat shock을 통해 competent cell의 세포벽에 틈을 생성한다. 그 후 cold shock으로 다시 세포벽을 안정화시켜 heat shock으로 세포벽에 생성되었던 틈을 막는다.
결과적으로, DNA 연결효소는 재조합 DNA 기술에 필수적인 효소이며, 그와 더불어 세균의 형질전환 기술은 유전자 조작에 있어 매우 중요한 과정이라 할 수 있다.
1.5. 플라스미드 추출과 분석
Mini prep은 plasmid preparation이라고도 하며, plasmid DNA를 소량 분리하는 방법이다. 본 실험에서 사용한 방법은 mini prep 중 가장 보편적으로 쓰이는 Alkaline lysis method이다. 이는 원형 플라스미드 DNA 또는 심지어 RNA를 박테리아 세포로부터 분리하기 위한 선택 방법이다.
세포로부터 DNA를 얻는 빠르고, 신뢰할 수 있고, 비교적 깨끗한 방법이기 때문에 아마도 가장 일반적으로 유용한 기술들 중 하나일 것이다. 필요한 경우, 알칼리성 용해 준비로부터 얻은 DNA를 추가로 정제할 수 있다. 알칼리성 용해는 플라스미드 DNA의 고유한 특성에 의존...
참고 자료
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