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환경호르몬이 유전자에 미치는 영향에 대한 기초 실험 - 유전자 변화관찰 평가A+최고예요

학사 학위 논문유기주석 화합물 TBT를 처리한 넙치, Paralichthys olivaceus, 생식소에서의 유전적 변화에 관한 연구Study on genetic change of flounder, Paralichthys olivaceus, genital exposed to organotin compound TBTC지도 교수 진 덕 희2000년 11월강릉대학교 생명과학대학해양생명공학부박혜은, 원오석, 하철원목 차Ⅰ. 서론 ··················· 2Ⅱ. 재료 및 방법 ··············· 41. Sample 준비- TBTC에 인위적으로 노출시킨 넙치 생식소2. RNA 분리3. cDNA의 합성4. PCR기법을 이용한 증폭5. 전기영동법을 이용한 유전자 확인Ⅲ. 결과 ·················· 6Ⅳ. 고찰 ··················· 8Ⅴ. 참고 문헌 ················ 12유기주석 화합물 TBTC를 처리한 넙치, Paralichthys olivaceus, 생식소에서의 유전적 변화에 관한 연구박 혜 은, 원 오 석, 하 철 원강릉대학교 해양생명공학부Study on genetic change of flounder, Paralichthys olivaceus, genital exposed to organotin compound TBTHea-Eun Park, Oh-Suk Won, Ch ul-Won HaDepartment of Marine and Life Engineering KangNung National University서 론삼면이 바다인 우리 나라는 동물성 단백질의 절반 이상을 수산물에 의존하고 있기 때문에 해양 환경이 매우 중요하다. 그러나 급속한 산업 발전으로 인한 연안 해역의 공업 폐수 및 도시 하수의 유입과 최근 내분비계 교란 물질(환경 호르몬)로 생태계가 파고 되고 있으며, 나아가서는 인간의 삶의 질을 저하시키고 있다. 특히 환경 호르몬은 생물체의 변이를 초래하여, 세계적으로 이 물질에 대한 관심이 높아지고 있다.보고된 바 있다.체내 호르몬은 synthesis(1단계), release(2단계), transportation(3단계), secondary messenger system(4단계), signal transduction(5단계), 대사 변화 및 기타작용(6단계)으로 크게 6단계로 작용을 한다. 환경 호르몬이 작용 할 수 있는 단계는 1∼5단계이다. 여기서 dioxin류 및 유기 주석 화합물의 영향은 5단계인 signal transduction의 작용을 저해한다. Signal transduction은 호르몬이 DNA에 작용하여 기능성 단백의 산생(産生)이나 세포분열의 조정을 지시하는 signal을 발생시키는 단계이므로 생체가 조직이나 기관의 형성 및 기능을 발현하는데 중요한 단계라고 할 수 있다. 그래서 생식소 유전자의 변화가 일어나서 생식소의 기능이 저하되거나 잘못된 기능을 나타낼 수 있다.그러나 TBT를 비롯한 환경 호르몬에 대한 연구는 주로 형태적인 이상이나 호르몬의 이상 생성 및 분비에 관한 것으로 지금 현재에도 활발히 진행되고 있으나 형태와 호르몬의 기능을 나타나게 하는 근본인 유전자의 이상에 대한 연구는 거의 미비한 실정이다. 그래서 본 실험에서는 동해안 주 양식 어종인 넙치를 대상으로 RT-PCR 기법을 이용하여 연안 해역에 많이 분포되어 있는 TBTC의 노출 일 수와 농도에 따른 유전자의 변화를 관찰하였다.재료 및 방법1. 시료 준비실험에 사용된 넙치는 이미 모든 조직과 기관 형성이 완성된 성어를 사용했으므로 암·수를 구별하지 않았다. 지용성의 TBTC(Tributytine chloride)는 물에 녹지 않으므로 에탄올 원액에 녹여 희석하여 사용하였다. 넙치 성어가 있는 수조에 TBTC 0.1, 1ppb의 농도로 처리한 뒤 노출 3일, 노출 11일 후에 생식소를 채취하였다. 그리고 수조에 에탄올만 첨가한 것을 대조구로 사용하였다.2. RNA 분리넙치 생식소를 homogenizer tube에 100㎎당 TRI reagent(Molecular Researgonucleotide dT/A를 사용하였다. RNA denaturation(변성)는 57℃에서 10분, cDNA synthesis(합성)는 42℃에서 60분, RTase inactivation(불활성화)은 94℃에서 5분을 MinicyclerTM(MJ Research)에서 실행하였다. cDNA 산물은 PCR에 사용하기 위해서 -20℃에서 보관하였다.4. PCR(Polymerase Chain Reaction)기법을 이용한 증폭증폭에 사용된 primer는 specific primer인 oligonucleotide dT/A와 arbitrary primer AP1∼AP8을 사용하였다(Table 1). PCR 반응은 PCR-Kit(250μM dNTP , 1U 열안정 DNA polymerase, 50mM Tris-HCl(pH 8.3), 40mM KCl, 1.5mM MgCl2)에 template DNA 2㎕, arbitrary primer(AP1∼AP8 중 1가지) 2㎕, specific primer는 14㎕를 첨가한 후의 최종 양이 20㎕가 되게 하였다. Predenatuation 95℃ 5분 실행한 후, denatuation(변성) 94℃ 1분, annealing(신장) 45℃ 2분, extension(합성) 72℃ 2분을 1cycle로 하여 35cycle을 MinicyclerTM(MJ Research)에서 실행하였다. 증폭 산물은 1% agarose gel(1X TBE 40㎖에 agarose 0.4g을 녹였다.)로 1X running buffer하에서 전기 영동을 수행한 후 UV에서 발광되는 Ethidium Bromide에 넣어 1시간 30분 정도 염색한 다음, UV 조사로 band를 확인하였다.Table 1. Arbitrary Primer Sequence used in amplification.Arbitrary Primer NumberArbitrary Primer SequenceAP15′-CAG GCC CTT C-3′AP25′-CAA TCG CCG T-3AP35′ttern이나 650bp에서 약한 band를 관찰할 수 있었다.AP3을 사용한 노출 3일 째의 control과 TBTC 0.1, TBTC 1의 band는 유사하게 나타났고, 노출 11일 째의 TBTC 0.1과 TBTC 1은 control과 유사하였지만 600bp이상의 band는 관찰할 수 없었다. AP4을 사용한 노출 3일 째 TBTC 0.1과 TBTC 1은 control과 유사해 보이나, 1000bp이하에서 새로운 band가 관찰되었다. 노출 11일 째 TBTC 0.1은 특이적으로 700bp에서 약한 band가 관찰되었다.AP5를 사용하여 증폭한 노출 3일 째의 TBTC 0.1과 TBTC 1에서는 control보다 무거운 band들을 관찰할 수 있었으나, TBTC 1은 750bp이상의 band를 관찰할 수 없었다. 반면에, 노출 11일 째의 TBTC 1은 750bp 이상의 band가 관찰되었다. AP6을 사용하여 증폭한 노출 3일 째의 TBTC 0.1은 고분자량의 band를 관찰할 수 없었으나, TBTC 1은 2000bp 이상의 선명한 band가 관찰되었다. 노출 11일 째의 TBTC 1은 control과 매우 유사한 pattern으로 보이나, TBTC 0.1은 band가 관찰되지 않았다.AP7을 사용한 노출 3일 째의 TBTC 0.1은 conrol과 유사하지만 TBTC 1은 저분자량의 band가 나타나지 않고 약하게 관찰되었다. 노출 11일 째의 TBTC 0.1과 TBTC 1은 control에서 관찰되는 600bp이하의 band는 관찰되지 않았으며, TBTC 1은 2000bp이상에서 band가 관찰되었다. AP1∼AP7까지의 control에서는 2000bp이상의 band가 관찰되지 않았는데, 특이하게 AP8을 사용한 PCR product에서는 800 ∼ 2000bp이상의 band가 관찰되며, 노출 11일 째 TBTC 0.1은 1200bp와 800bp에서 매우 약한 band가 나타났다.TBTC에 노출된 넙치 생식소의 유전자 변화를 위에서 비교·분석한 결과 T도 하나의 방법이다.부착 방지 효과를 높이기 위해 TBT와 TPT를 같이 사용하여 연안 해역에는 TBT 뿐만 아니라 TPT에 대한 노출도 매우 위험하다. TPT는 TBT보다 독성이 강하지는 않지만, 고농도의 TPT에 영향을 받은 고둥류의 암컷 생식기에서는 penis(수컷의 생식기)가 생기는 imposex현상이 발견되어서 고농도의 TPT도 유독하다고 할 수 있다(Shim et al., 2000). TPTC에 노출된 넙치 생식소 유전자의 변화는 TBTC에 노출된 생식소 유전자와 유사한 pattern을 보이나, AP4, AP6을 사용하여 TPTC에 노출된 유전자를 증폭하면 저분자량의 PCR product가 관찰되지만, TBTC는 500bp이상의 무거운 band가 관찰되었다. TBTC의 AP5 전기 영동 사진을 보면은 TPTC의 AP5 전기영동 사진에서 나타난 smile effect는 나타나지 않았다. TBTC와 TPTC 각각에 노출된 유전자의 변화는 화합물에 따른 차이를 보이지 않았지만, TPTC에 11일간 노출된 생식소 유전자는 control과는 큰 차이를 보이지 않았는데, TBTC 0.1ppb에 11일간 노출된 생식소의 유전자는 control과 다른 pattern을 보였다. 지금까지의 다른 연구 보고에서는 TBTC와 TPTC가 생체내에 축적되는 양과 생식소에 이상을 일으키는 독성의 차이가 있다고 했으나, 본 실험에서는 TBTC와 마찬가지로 TPTC도 저농도에서 유전자에 영향을 미쳤음을 알 수 있었다.Control과 비교했을 때 새로운 band가 나타나거나 그 위치에서 나타나야할 band가 없을 경우에 유전자의 이상이 생겼다고 한다. 본 실험의 결과에서는 AP3을 사용하여 증폭한 유전자의 변화가 거의 없는 것을 제외하고는 대부분의 PCR product에서 유전자 변화를 쉽게 파악할 수 있으므로 유전자의 이상이 생겼다고 할 수 있다. Fig. 1과 Fig. 2에서 보면 RT-PCR기법으로 유전자를 증폭 할 때 primer와 결합되지 않고 남은 것이 backgroun다.

자연과학| 2000.12.09| 13페이지| 무료| 조회(5,234)

환경호르몬, 유전자, 해양, TBT, TPT

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