중합효소 연쇄반응(重合酵素連鎖反應) 또는 폴리머라아제연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)이라고 불리운다.전체 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid/DNA)게놈에서 염기서열을 이미 알고 있는 특정 DNA 절편만을 선택적으로 복제하여 증폭시킴으로써 시험관내에서 효과적으로 DNA를 탐색하고 분리할 수 있는 기법으로 아주 적은 양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능하므로 분자 생물학적으로 제한효소의 발견만큼 획기적인 것이라고 할 수 있다. 즉 genomic DNA와 같은 아주 큰 DNA로부터 원하는 DNA 부분만을 선택적으로 증폭시킨 후 일반적으로 사용되는 agarose gel이나 polyacrylamide gel 상에서 뚜렷하게 보이는 band로 가시화할 수가 있다. DNA 폴리머라아제가 프라이머를 이용하지 않으면 DNA합성을 개시할 수 없다고 하는 성질을 이용하여, DNA가 떨어진 2점간에 결합하는 프라이머를 사용하여 그 동안의 DNA만을 증폭시키는 반응방법이다.중합효소 연쇄반응을 통하여 in vitro상에서 특정 부위의 DNA를{ 10}^{5 }∼ { 10}^{8 }배까지 수시간내에 증폭시킬 수 있으며, 이렇게 증폭된 DNA를 다음과 같이 여러가지 실험에 이용할 수 있고, 실험 결과를 토대로 여러 의학적인 연구에 응용할 수가 있다.목표하는 부위의 양쪽 염기서열과 보합적인 염기서열로된 올리고뉴클레오티드를 합성하여 시발체로 사용한다. DNA 중합효소에 의하여 서로 반대 방향으로 DNA 조각을 합성하는 반응이 일어난다. 올리고뉴클레오티드 시발체를 충분히 넣고 4 가지 dNTP 를 넣은 상태에서 주형 DNA를 가열하여 변성시킨다. 다음에 반응 온도를 낮추어서 단일쇄인 시발체가 변성된 단일쇄 주형 DNA에 결합 (annealing)되도록 한다. DNA 중합효소 I 에 의하여 DNA 가 5’ 에서 3’ 방향으로 합성된다. 다시 가열하면 원래의 주형 DNA 와 새로 합성된 분자가 시발체와 다시 결합하고 다시 DNA 합성을 위이 연속부분은{ 2}^{n }배로 증폭된다. 20주기 후에는 100만배, 30주기 후에는 10억 배로 증폭되는데, 여기까지 걸리는 시간은 1시간도 되지 않는다.이 훌륭한 DNA 증폭법에는 몇 가지 주목할 만한 특징이 있다. 첫째, 표적 C의 염기결합순서는 몰라도 된다. 필요한 것은 양 옆으로 있는 B와 D의 염기 결합순서이다. 둘째, 표적은 시발물질보다 훨씬 클 수 있다. 10kb 정도 되는 큰 표적도 PCR로 증폭되었다. 셋째, 표적을 증폭하기 위해서라면 시발물질들이 양 옆의 연속부분과 완전하게 합치할 필요는 없다. 어떤 유전자의 염기 결합순서가 알려져 있으면, 조금씩 다른 유사한 유전자 가족들을 찾을 수 있다. PCR법으로 유사한 유전자 무리들을 발견하였다. 넷째, 높은 온도에서 혼성체화하는 엄격성 때문에 PCR은 특이성이 매우 높다. 증폭되는 것은 주형과 혼성체를 형성한 두 시발물질들 사이에 있는 DNA만이다. 고등생물의 전체 DNA의 100만분의 1보다 작은 특정한 유전자도 PCR로 증폭이 가능하다. 다섯째, PCR은 매우 민감하므로, 단 한 개의 DNA 분자도 증폭해서 검출할 수 있다.①PCR의 발명캐리 B. 멀리스(Kary B. Mullis, 1944∼ . 미국의 생화학자)는 캘리포니아대학교(버클리 소재)에서 생화학분야 박사학위를 취득했다. 그는 폴리머라아제 연쇄반응(PCR) 방법을 발명하여 1993년 마이클 스미스(Michael Smith, 1932∼2000. 캐나다의 생화학자)와 함께 노벨 화학상을 공동 수상했다.그의 PCR방법과 마이클 스미스가 발견한 위치 지시적인 돌연변이발생의 방법은 유전공학의 급속한 발전을 가져오고 기초적인 생화학 연구에 큰 자극제가 됨으로써, 의학과 생명기술에 새로운 방법을 도입시켰다.멀리스의 PCR방법은 이미 많이 적용되고 있다. 예를 들어, 간단한 장비를 가지고서 복잡한 유전자물질로부터 어떤 하나의 DNA 부분을 단지 몇 시간 안에 수백만배 증가시키는 것이 가능하게 되었다. 이 방법은 특히 의학진단학에서 새로운 가능성 myc, fos 등4) 유전성 질병의 진단: Progressive muscular dystrophy (Duchenne type)등5) 감염성 질병의 진단: Streptococcus, Salmonella, Hepatitis virus 등PCR의 이용으로 DNA의 염기 결합순서 결정과 클로닝이 매우 간단해졌다. 더욱이, 이 혁신적인 기법으로 재조합 DNA 기술의 응용 범위와 위력이 두드러지게 증대되었다. 의학분야에서는 PCR로 진단에 매우 유용한 정보를 얻을 수 있다. 특이한 시발물질을 사용하면, 박테리아와 비루스를 간단히 검출할 수 있다. 예를 들면, 사람 면역결핍 비루스-1(HIV-1)의 예를 보면, 이 병원 비루스에 대한 면역반응이 아직 나타나지 않아서 항체 검사로는 놓칠 수 있는 감염자의 경우에도 PCR은 비루스의 존재를 밝힐 수 있다. 조직 표본에서 결핵균 Mycobacterium tuberculosis를 검출하는 일은 느리고도 고된 작업이다. PCR을 사용하면, 사람의 세포 100만 개에 있는 불과 10개의 결핵균을 쉽게 검출할 수 있다. 또 PCR은 어떤 종류의 암의 조기 진단에도 유망한 기법이다.RAS 유전자들과 같은 성장조종 유전자들의 돌연변이가 PCR로 확인될 수 있다. 또한 DNA의 특정 구역만을 선택적으로 증폭시킬 수 있으므로, 암의 화학요법을 감시하는 수단으로 사용하면 유용한 정보를 얻을 수 있다. 이상적인 것을 말하면, 화학요법은 암세포가 제거되었을 때 중지했다가, 재발하면 즉시 재개하는 것이 좋다. PCR은 염색체의 재배열이 원인이 되어 생기는 백혈병의 검출에 이상적인 기술이다.PCR은 법논쟁과 법의학에도 강력한 영향을 미치고 있다. 많은 유전자 자리들은 한 집단 안에서도 개체에 따라서 다양성이 매우 크기 때문에, DNA의 염기 결합순서로 개체들 사이의 차이를 확실히 식별할 수 있다. 예를 들면, 장기이식에서는 제공자와 수용자의 HLA(사람 백혈구 항원)의 형이 충분히 맞지 않을 때는 거부반응이 일어난다. PCR에 의한 여러 유전자들의163656*************81**************************83*************173757*************296*************81838587*************57*************9193표. Primer 길이와 조성에 따른 annealing 온도3) DNA의 합성(polymerization)70°C∼74°C에서 시행하며 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시키는 것이 좋다. Taq DNA polymerase는 보통 1분에 2,000∼4,000 nucleotides를 합성할 수 있으므로 원하는 PCR 산물의 크기 1 kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어날 수 있다. Cycle이 계속되면서 효소 활성이 감소할 수 있고 DNA 산물은 점점 많이 존재하게 되므로 cycle 후반부에는 반응시간을 조금씩 늘려가는 것도 좋은 방법의 하나이며, 마지막 cycle에는 시간을 충분히(10분) 주어 효소의 활성이 충분히 발휘되도록 한다.위 과정이 계속 반복하여 진행되면서(보통 25∼35회) 원하는 DNA 부분을 증폭시키는 것이 중합효소 연쇄반응의 원리이다.④실험방법1. 실험에 이용할 PCR 시험관에 다음과 같이 실험에 사용할 재료들을 혼합하고 pipette으로 잘 섞는다.Template DNA(100 ng/μl) 1 μlUpstream primer(12.5 pmole/μl) 1 μlDownstream primer(12.5 pmole/μl) 1 μldNTP(dA, dC, dG, dT 2.5 mM-each) 2 μl10x PCR 완충용액 5 μl증류수 39 μlTaq DNA polymerase(1 unit/μl) 1 μl (총 부피 50 μl)* 10x PCR 완충용액(100 mM Tris-Cl, pH 8.3, 500 mM KCl, 15∼20 mM magnesium chloride, 0.01% gelatin 또는 bovine serum albumin[BSA])은 효하면 주문에 따라서 정제도 해준다. 정제는 Sep-pak, OPC나 PAGE 정제를 이용하는데, 가능하면 PAGE 정제된 primer를 쓰도록 한다.Primer의 양은 0.1~0.5 μM로 시행한다.3. dNTP (deoxynucleotide triphosphate)시약상에서 dATP, dCTP, dGTP와 dTTP(각각 100 mM stock)을 구입한 후 혼합하여 사용한다. 양은 target DNA의 길이에 따라 다를 수 있으나 각각 20∼200 μM 정도를 사용한다.4. 10x PCR 완충용액1) Magnesium다음과 같은 여러가지에 영향을 주는 중요한 요소이다.A, Primer가 template DNA에 결합하는 능력B. Template 및 PCR 산물의 변성온도C. Product specificityD. dNTP와의 결합E. Taq DNA polymerase의 활동성F. Primer-dimer artefact의 형성*반응물내에 EDTA와 같은 chelator가 포함되면 농도를 올려 주어야 하고, dNTP나 template의 농도가 높으면 MgCl2의 농도를 높게 변화시켜야 한다.*위에 나열한 Mg의 기능중 A, B, C, D는 농도가 높을수록 실험에 유익하고 E, F는 농도가 낮을수록 실험에 유익하므로 최적 농도를 유지할 수 있도록 노력해야 한다.*반응이 잘 일어나지 않으면 0.5 mM부터 2.5 mM(때로는 8 mM까지)사이에서 농도를 변화시켜 가면서 최적조건을 찾도록 한다.2) KClPrimer가 target DNA에 결합하는 것을 도와주며, Taq DNA polymerase의 반응율을 높여준다.3) Gelatin 또는 bovine serum albumin(BSA)Taq DNA polymerase를 안정화한다.* 일부 보고에 의하면 반응완충용액내에 KCl이나 gelatin, BSA 등을 첨가하지 않는 것이 더 좋다는 설도 있다.5. Taq DNA polymeraseTaq는 온천에서 사는 Thermus aquaticus라는 균주에서 따온 이름이다..
전기영동이란, 콜로이드용액 속에 직류전압을 통했을때 용액중의 하전입자(콜로이드입자)가 양극 또는 음극으로 이동하는 현상을 말하며, 전기이동(電氣移動)이라고도 한다.1808년 F.F.루스에 의해 처음으로 발견되었다.1. 전기영동의 원리( The principle of electrophoresis)콜로이드입자가 대전(帶電)하고 있기 때문에 생기는 현상이다. 예를 들면 수산화철 이나 수산화알루미늄 등의 콜로이드입자는 음극(cathode)쪽으로 이동하고, 황·금·은 등의 콜로이드나 황화물·규산 등이 분산된 콜로이드용액에서는 입자가 양극(anode)쪽으로 이동한다. 입자의 이동속도는 입자 계면에서의 전기운동학적인 전위차에 의해서 변하며, 전해질이 흡착되면 이 전위차의 크기가 변화하므로 입자의 전하량, 크기와 모양, 용액의 pH와 점성도, 용액에 있는 다른 전해질의 농도와 이온의 세기, 지지체의 종류에 영향을 받는다. 따라서 콜로이드입자의 각종 성질이 같다고 해도 어느 하나가 다르면 전기이동에 의해서 입자를 분리할 수가 있다.전기영동에서 다루는 것은 전기화학적 기법에서의 전극의 반응이나 이온 교환에서의 반대로 하전된 이온들의 상호 작용이 아니라 전기장의 영향에 의한 분자의 이동도(mobility)이다. 전기장 내에서의 하전된 분자(입자)의 속도는 저지력(retarding force)들의 결합과 가속력(전기장)에 의해 조절된다. 따라서 하전된 분자는 중력의 영향에 의해 어떤 입자(particle)가 낙하되는 것과 유사한 방법으로 최종속도에 도달하여 유지될 것이다.전기장의 세기가 1volt/cm일 때의 어떤 알맹이의 이동속도를 전기이동도(electrophoretic mobility, μ)라고 한다. q라는 전하를 가진 알맹이가 전류의 세기 E인 절연된 전기장에 있을 경우 전기이동도는 다음과 같이 정의된다.μ= { v} over {E }= {q} over {f }= {qD } over {kT }여기서, v = 알맹이의 속도(cm/sec)E = 전기장의 세기q = 알맹이의 알짜겨 전기이중상을 형성하는데, 이온력이 클수록 단백입자 주위 에 이온층이 더욱 조밀하게 되고 이온력을 감소시킴에 따라 양이온층이 희박하게 된다. 결과적으로 이온력이 클수록 단백입자의 이동율은 느리게 된다.고로, 낮은 이온력을 갖는 완충액을 써야 전기영동이 빨리 이루어진다. 반면 단백입자의 확산이 증대되는 문제점을 해결하기 위해 단백입자가 확산하는 시간을 주지 않도록 전압을 올리므로 분리 시간을 단축시킬 수 있다..전하에 미치는 pH의 영향에 대해서 좀 더 자세하게 알아 보겠다.단백질과 같은 분자의 표면 전하에 미치는 pH의 영향은 이온화가 가능한 기(group)들의 수와 유형에 따라 좌우된다. 이러한 산성 또는 염기성기들의 효과는 단백질이 고유 pH(등전점 pI)에서 순 영전하(net zero positive charge)로 된다. 등전점보다 낮은 pH에서 단백질은 순 양전하를 나타내며 pH가 감소할수록 순 양전하는 증가하고, 전기영동에서 단백질의 이동이 증가된다. 등전점보다 높은 pH에서는 단백질은 순 음전하를 가지게 되며 pH를 높임에 따라 이동도도 증가할 것이다. 그러나 이 경우 방향은 반대가 된다. 분자 전하에 대한 pH의 효과는 이온 교환에서와 같이 전기영동에 있어서도 중요하다. 이와 같은 현상은 산과 염기들에서도 나타나는데, 차이점은 pH의 변화에 따라 전하의 극성은 변하지 않고 단지 전하의 크기만 변한다는 점이다. 예를 들면, pI보다 상당히 낮은 pH(적어도 pH 단위로 2이하)에서 산은 본질적으로 이온화 형태로 존재하므로 전기영동에 기여하지 못하게 된다. 아울러 실제에 있어서는 전기영동적 이동도와 전하 사이의 상호 관계는 더욱 복잡하게 나타난다. 하지만 pI의 개념은 효과적으로 이용할 수 있다.2. 전기영동의 종류전기영동은 매우 광범위한 분석(analytical)과 조제(preparative)기법의 기초를 제공한다. 이들 중 대부분의 경우는 전기영동적 이동도의 차이특성과 다른 분리적 메커니즘들을 결합하여 '혼합 기법(hybrid technique이루게 되며, 여과지 밑바닥에서 시험관에 분획별로 모을 수 있다.@전기영동시 사용하는 완충액의 역할완충액이란 약산과 그 염류 혹은 약염기와 그 염류를 함께녹여 만든 용액으로 소량의 산이나 염기를 가해도 수소이온농도의 변화가 없이 일정한 pH를 유지시킬 수 있는 용액이며, 이들은 수용액중에서 일부만 이온화 되는데, 이온화 되는 정도는 거의 일정하다.이온화 농도는 pK치로 표시하며, 해당되는 산 또는 염기가 결정되면, 필요한 pH의 용액을 쉽게 얻을 수 있다.사용되는 산이나 염기 및 그 염류의 혼합비와 해리상수를 알면 Henderson-Hasselbach공식에 의해 pH를계산할 수 있다.pH = pK + log(salt)/(acid)전기영동에서 용액의 pH가 변하면 단백표면의 아미노산 해리상태가 변하게 되므로 항상 일정한 분획치를얻기 위하여는 일정한 pH를 유지해야 한다. 아울러 완충용액의 이온강도에 따라서 이동도가 달라지는데,이온강도가 클수록 이동거리가 짧아진다. 반면 이온강도가 작을수록 완충능력이 떨어지므로 장시간의영동에는 적합하지 않다. 일반적으로 혈청단백 분획에는 이온강도가 0.06 - 0.07인 완충액을 많이 사용한다.등전점(isoelectric point, pI)이란 용액내에서 어떤물질의 양이온량과 음이온량이 같아지는 시점의 용액의pH를 말하며, pH가 등전점보다 산성이면 양전하를, 알칼리성이면 음전하를 띠게된다.4) 종이 전기영동종이는 전기영동에서 가장 최초로 사용된 지지 물질중 하나이며 여러 가지 형태로 이용되어져 왔다. 하지만 그 작동 원리는 동일하다. 완충액이 흠뻑 젖은 종이위에 점(spot)또는 띠(band)형태로 시료를 얹고 종이 양단을 더 많은 완충액 이 담긴 적절한 용기 내의 전극과 전기적으로 연결시킨다. 성분의 이동이나 분리는 전기 장 영향으로 일어나게 된다. 샌드위치형(sandwitch type)에서 지지 물질로 사용되는 종이는 두 장의 유리판 사이에 끼이도록 되어 있다. 이러한 형태는 발생된 열을 분산 시키는 열전도의 양을 제한하며 후 염색을 하거나 염색과 관련된 변성 용매에 의해 고정하여야 한다. 후자의 경우 대표적인 용액으로는 10%(V/V) 아세트산이 있는 0.25% Coomassie blue를 메탄올 수용액(1:1, V/V)에 탄 것이 있다. 약 10시간 정도 염색하 며, 과도하게 염색된 경우는 염료가 없는 동일한 용매 혼합물에 겔을 담그어 염료를 제거 할 수 있다. 겔을 관에 넣고 보다 농도가 높은 완충액을 사용하여 전기영동을 한다. 이때 단백질은 불용성이므로 움직이지 않으나 염료는 전하를 띠므로 재빨리 겔에서 이동해 나간다.전분 겔은 혈장 단백질과 같은 단백질의 분리와 식별에 광범위하게 이용되어 왔으나, 차츰 재현성과 동질성이 뛰어난 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide)로 대치 되고 있다.(2) 아가로즈 겔 전기영동아가로즈(agarose)는 갈락토스(galactose)와 겔리듐 아만시 (Gelidium amansii)의 한천(aga -r)으로부터 유도된 3,6- 안하이드로칼락토스 단위체들 (anhydrogalactose units)로 구성되는 천연의 다당류이다. 겔은 전분 겔과 유사한 방법으로 끓는 물에 건조한 중합체를 넣고 상온 에서 식힘으로써 얻어진다. 전분 겔보다 다공성 구조이며 적절한 강도를 가진다. 아가로즈 겔(agarose gel)에서의 전기영동은 보다 진정한 의미 의 전기영동으로써 하전된 분자들은 전기장의 영향에 의해 이동하나 지지 물질 에 의해 저지되지 않는다. 아가로즈 겔을 이용한 전기영동은 가장 큰 거대 분자와 그 복합체인 바이러스, 효소 복합체, 지질단 백질(lipoprotein), 핵산(nucleic acid)등 의 전기영동에 이용되고 있다.-Agarose gel 전기영동시 DNA의 이동에 영향을 주는 요인들DNA 분자의 크기가 클수록 느리게 이동한다.Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동한다.DNA 형태(구조)에 따라 이동속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA가 가장 빨리, 그다음 linear DNA, open circula역 전기영동과 유사한 방법으로 일정한 전계 강도에 놓여진다. 이때 사전 농축(pre-concentration)의 결과로 분해력이 향상되는 장점이 있다. 여러 가지 형태의 겔, 시료 쌓인 겔과 분리용 겔 등의 사용은 기술상으로 복잡해지므로 많은 변화를 성공적으로 수행하였지만 모두 단일 겔 시스템에 기본을 두고 사용된다. 완충 시스템의 불연속적인 성질은 전극 완충제에 비하여 분리용 겔 내의 완충제 농도를 증가함으로써 유지할 수있다. 시료 겔은 전기영동 전에 관의 상부에서 확산을 방지하 기 위해 점도가 높은 수크로즈(sucrose)나 글리세롤(glycerol) 등의 매질 내에 시료를 첨가하여 투여할 수 있다.(5) SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동겔 내에서 하전된 분자의 이동도는 분자의 크기와 전하에 의해 결정하며 상대적인 분자량이 다르더라도 특정 상황 아래서는 동일한 전기영동적 이동도를 가질 수 있다. 단백질은 완충용액과 반응하여 순전하나 분자량에 관계없는 응집된 형태로 도 전기영동중에 이동할 수 있으므로 상황이 아주 복잡해진다. 이러한 문제점을 극복하 기 위해 사용되는 한 가지 방법은 도데실 황산나트륨(sodium dodecyl sulfate : SDS)과 같은 음이온으로 된 세제(detergent)를 완충 용액 내에 넣어 사용하는 것이다. SDS는 단백질내의 소수성 부분에 결합하여 단백질 분자들간의 소수성 부분의 결합 가능성을 억제시킨다. SDS는 또한 단백질에 많은 음전하를 제공하며, 단백질 내에서의 하전된 기(group)들의 영향을 크게 감소시킨다.이러한 상황에서는 단백질의 전기영동적 이동도는 상대적 분자량의 대수(log)값에 반비례하는 특성이 생긴다. 정확한 상관 관계는 사용하는 겔의 성질에 좌우되므로 상대적인 분자 질량을 측정하기 위해서는 이미 상대적인 분자의 질량이 알려진 단백질 로 검량을 하지 않으면 안된다.단백질의 소단위(subunit)들은 때로는 이황화다리(disulphide bridges : cystine)로 결합할 수 있으며, SDS는 이결있다.
